构建BVDV-NS5B稳定表达的细胞系

论文摘要

牛病毒性腹泻（亦称粘膜病）是世界动物卫生组织（Office International desépizooties,OIE）必须上报的传染病之一。其病原是牛病毒性腹泻病毒（Bovine viral diarrhoea virus,BVDV）。BVDV为黄病毒科（Flaviviridae）瘟病毒属（Pestivirus）的代表成员。BVDV能感染的动物主要包括牛、羊和猪等,最近发现BVDV也能感染小鼠。但是其天然宿主为牛,尤其是幼龄牛的易感性最高。感染BVDV之后引起牛发病,产生的症状不一,有的急性感染,损伤牛的健康,重症者死亡;有的持续感染,无明显症状,却成为主要的传染源,并且由于免疫抑制作用,导致继发其他疾病而放大其危害。目前在防控BVDV方面,欧美国家已经积累了较丰富的经验,主要采用“筛查+淘汰”和“免疫+淘汰”两种净化策略。前者建立在有效的诊断基础之上,且淘汰成本高;后者依赖高效的疫苗免疫,适用于养牛密度高,且BVDV流行率高的地区。因此,第二种策略较适应我国当前情况。要很好地控制在我国BVDV的流行,研究和生产高效疫苗成为当务之急。BVDV的基因组约为12500核苷酸的正链RNA,一个开放阅读框编码一个大的蛋白,然后被剪切为12个蛋白。最后一个蛋白为其RNA聚合酶NS5B,缺乏此蛋白病毒基因组将不能复制,病毒在宿主细胞中将不能增殖,而失去连续感染能力。本实验室已经成功构建出NS5B缺失的BVDV疫苗病毒,所以要构建NS5B基因稳定表达的生产细胞系,以遗传互补的方式使NS5B缺失的BVDV疫苗病毒在配套细胞系中增殖。项目的完成,将有望弥补我国BVDV疫苗生产中的不足,对控制我国BVDV具有非常重要的意义。根据NS5B核酸序列设计并合成上下游引物,以实验室保存的从BVDV病毒液中提取的RNA反转录成的cDNA为模板,通过PCR扩增出NS5B核酸序列,然后与pLVX-IRES-Puro载体连接,构建pLVX-IRES-Puro-HA-NS5B重组质粒。重组质粒经过鉴定之后,与包装载体（PLP1、PLP2、pLP/VSVG）共转染293T细胞,48h和72h分别收集病毒液感染MDBK细胞,感染48h之后用含有嘌呤霉素的培养基筛选阳性细胞,直至单克隆出现并逐级扩大培养。另外将pLVX-IRES-Puro-HA-NS5B直接转染BHK细胞,并通过嘌呤霉素筛选获得表达NS5B蛋白的BHK细胞系。本研究利用原核表达系统成功表达了NS5B抗原表位,并对其进行纯化,经过测定最高浓度可达430μg/mL,然后经过弗氏佐剂乳化免疫小鼠,免疫三次之后摘除眼球致死获得抗NS5B的血清,经过ELISA效价测定,最高效价可达1:64000,因此获得有效的血清用于后期Western Blot检测表达NS5B蛋白的细胞系,也可以检测BVDV。总之,本实验成功获得抗NS5B的血清,成功构建NS5B稳定表达的BHK细胞系,为NS5B缺失的BVDV疫苗病毒提供了配套生产细胞系,以反向遗传互补方式获得BVDV基因缺失病毒奠定基础。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一部分 文献综述
•   1 牛病毒性腹泻（Bovine viral diarrhea,BVD）
•   2 BVDV
•     2.1 BVDV的基因组特征
•     2.2 BVDV-NS5B基因和功能
•     2.3 BVDV的分类
•     2.4 BVDV的检测方法
•     2.5 BVDV的流行情况
•     2.6 BVDV的防控
•   3 慢病毒载体系统
•   4 本研究的目的与意义
•   5 技术路线
• 第二部分 BVDV-NS5B抗原表位肽的原核表达与纯化
•   1 实验材料
•   2 实验方法
•     2.1 NS5B基因抗原表位预测和设计
•     2.2 NS5B原核表达载体的构建
•     2.3 NS5B原核表达载体鉴定
•     2.4 NS5B的表达与纯化
•     2.5 SDS-PAGE和 Western Blot鉴定纯化的NS5B蛋白
•     2.6 纯化蛋白的浓度测定
•   3 实验结果
•     3.1 BVDV-NS5B抗原表位的设计
•     3.2 BVDV-NS5B原核表达载体的鉴定
•     3.3 SDS-PAGE鉴定蛋白表达最佳条件
•     3.4 蛋白的可溶性分析
•     3.5 蛋白的纯化结果和浓度测定
•   4 讨论
• 第三部分 BVDV-NS5B抗原表位肽免疫原性研究
•   1 实验材料
•   2 实验方法
•     2.1 NS5B蛋白抗血清的制备
•     2.2 NS5B蛋白抗血清效价的测定
•     2.3 NS5B蛋白抗血清特异性检测
•   3 实验结果
•     3.1 NS5B蛋白抗血清的效价
•     3.2 NS5B蛋白抗血清Western Blot检测
•   4 讨论
• 第四部分 稳定表达BVDV-NS5B蛋白的细胞系的建立
•   1 实验材料
•   2 实验方法
•     2.1 NS5B慢病毒载体的构建与鉴定
•     2.2 慢病毒的包装
•     2.3 慢病毒的有效性测定
•     2.4 NS5B稳定表达细胞系的筛选
•     2.5 表达NS5B细胞系的鉴定
•     2.6 表达NS5B蛋白细胞系稳定性的鉴定
•   3 实验结果
•     3.1 NS5B基因扩增
•     3.2 NS5B慢病毒载体的构建
•     3.3 pLVX-IRES-Puro-HA-NS5B重组质粒在293T细胞中表达..
•     3.4 MDBK细胞和BHK细胞嘌呤霉素的最小致死浓度的确定.
•     3.5 慢病毒的有效性测定
•     3.6 稳定表达NS5B蛋白细胞系的筛选
•   4 讨论
• 第五部分 结论
• 参考文献
• 附录1 实验仪器和设备
• 附录2 实验试剂和材料
• 附录3 相关试剂配制
• 致谢

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 夏国建

导师: 何成强

关键词: 牛病毒性腹泻病毒,蛋白,慢病毒载体,细胞,原核表达

来源: 山东师范大学

年度: 2019

分类: 基础科学,农业科技

专业: 生物学,畜牧与动物医学

单位: 山东师范大学

基金: 山东省重点研发计划(2017GNC10125)

分类号: S852.65

总页数: 78

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