运用CRISPR/Cas9技术构建FosB基因敲除小鼠模型与对Plcg2（缺失外显子20-22）小鼠的初步研究

论文摘要

家族寒冷性荨麻疹中有一种家族患病与人类16号染色体上磷脂酶Cγ2（phospholipase C gamma 2,Plcg2）基因缺失20至22号外显子密切相关,这种缺失引发了多个白细胞亚群中信号传导异常,导致了机体免疫紊乱表型的出现。为了进一步探究Plcg2介导相关细胞亚群的信号转导异常的具体机制,本课题对已构建的Plcg2基因缺失20-22号外显子模型小鼠的相关免疫细胞百分比及钙离子通量变化情况进行检测分析,确定该模型小鼠对下一步机制研究的可靠性。同时,Plcg2基因的研究中发现通过细胞RNA测序发现FosB基因在生发中心B细胞相比于初始B细胞存在着高表达现象,为了进一步探究该基因对外周淋巴细胞的具体功能和作用机制,课题计划构建FosB基因敲除小鼠模型从而为深入探究相关功能和机制提供可靠的实验对象。新一代基因编辑技术CRISPR/Cas9是一种简便快捷的基因编辑工具,它的开发应用极大地方便了生物科学研究。本研究通过CRISPR/Cas9技术平台,使用sgRNA和Cas9蛋白对小鼠胚胎进行显微注射来获得FosB基因敲除小鼠模型。运用流式细胞术对Plcg2（exon20-22）小鼠检测分析各免疫器官和腹水中T、B淋巴细胞及亚群细胞的变化状况,以及脾脏中B淋巴细胞的钙离子流的变化状况。结果显示:部分胚胎注射小鼠的FosB基因经体内编辑发生了移码突变并能稳定遗传。而对Plcg2基因大片段敲除模型小鼠的检测表明,Plcg2Δ20-22/Δ20-22与Plcg2+/+相比部分T、B淋巴细胞亚群的百分比存在显著的差异性,而脾脏B淋巴细胞中,T1与T2细胞亚群钙流变化趋势基本一致,仅FO细胞亚群峰值明显下降。Plcg2+/Δ20-22与Plcg2+/+相比T、B淋巴亚群细胞及脾脏B淋巴亚群细胞钙流变化趋势均无明显变化。综上所述:FosB基因敲除小鼠模型构建成功,Plcg2的缺失主要对B淋巴细胞生长发育与钙离子通道具的调节有较大影响。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 绪论
• 第一章 应用CRISPR/Cas9 技术建立FosB基因敲除小鼠模型
•   1 材料
•     1.1 菌株和载体
•     1.2 细胞系
•     1.3 试验动物
•     1.4 主要试剂
•     1.5 主要仪器设备
•     1.6 主要试剂的配制
•   2 方法
•     2.1 FosB基因sgRNA与敲除方案设计
•     2.2 Crisper/Cas9 敲除质粒的构建
•     2.3 敲除载体在细胞水平上的验证
•     2.4 sgRNA体外转录与酶切
•     2.5 显微注射sgRNA与 Cas9 蛋白混合物
•     2.6 基因敲除小鼠的鉴定
•   3 结果
•     3.1 FosB基因sgRNA序列与敲除方案
•     3.2 敲除载体的鉴定
•     3.3 细胞转染效率
•     3.4 对转染敲除质粒的L929 细胞PCR鉴定和T7E1 酶切结果
•     3.5 sgRNA体外转录与Cas9 酶切验证
•     3.6 F0 代基因敲除小鼠的鉴定结果
•     3.7 配对繁殖得到纯合FosB敲除小鼠
•   4 讨论
• 第二章 Plcg2 基因大片段敲除模型小鼠初步研究
•   1 实验材料
•     1.1 实验动物
•     1.2 主要试剂
•     1.3 主要仪器设备
•   2 实验方法
•     2.1 Plcg2 基因大片段敲除设计
•     2.2 模型小鼠基因型鉴定
•     2.3 模型小鼠表型观察
•     2.4 检测免疫器官内免疫细胞变化
•     2.5 脾脏中B淋巴细胞钙流检测
•   3 结果与分析
•     3.1 Plcg2 基因敲除方案的确定
•     3.2 模型小鼠基因型鉴定
•     3.3 Plcg2 基因cDNA扩增引物序列
•     3.4 模型小鼠表型观察
•     3.5 免疫器官中免疫细胞检测
•     3.6 脾脏中B淋巴细胞钙流检测
•   4 讨论
• 第三章 结论
• 参考文献
• 攻读学位期间承担的科研任务与主要成果
• 致谢
• 个人简历

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 李奎

导师: 王德民

关键词: 基因突变

来源: 福建师范大学

年度: 2019

分类: 基础科学,医药卫生科技

专业: 生物学,皮肤病与性病

单位: 福建师范大学

分类号: R758.24;Q78

DOI: 10.27019/d.cnki.gfjsu.2019.000991

总页数: 85

文件大小: 3183k

下载量: 4