尼古丁代谢酶Pno电子传递的研究和尼古丁转化工程菌的应用

论文摘要

烟草是重要的经济作物,但其生产过程中会产生大量的含有尼古丁的废弃物。因为尼古丁是一种具有毒性的含氮杂环化合物,这些含有尼古丁的废弃物如果处理不当,会污染环境并影响人类健康。因此,必须开发有效的技术来处理或回收利用烟草废弃物。在多数情况下,与物理和化学方法相比,微生物可以更高效、更经济地无害化处理有毒化学品。据文献报道已发现多种微生物可以降解代谢尼古丁,比如本论文使用的Agrobacterium tumefaciens S33可以通过新型的吡啶途径和吡咯途径的“杂合途径”氧化降解尼古丁,进而以尼古丁为唯一碳源、氮源和能源生长。在该途径中,吡啶环被开环分解之前至少有六个步骤是氧化还原反应,S33通过这六个氧化还原反应将电子从尼古丁及其中间代谢物沿着电子传递链（ETC）传递到最终的电子受体02,最终通过氧化磷酸化合成ATP获得能量。在这六个氧化反应中,催化第四步反应（6-羟基假氧化尼古丁氧化脱氨生成6-羟基-3-琥珀酰半醛吡啶）的6-羟基假氧化尼古丁氧化酶Pno的生理电子受体仍不清楚。此外,该途径中一些中间代谢物可以作为底物进一步化学合成一些有价值的药物,如6-羟基尼古丁,这为资源化利用烟草废弃物和尼古丁提供了新途径。因此,本论文主要对A.tumefaciens S33降解尼古丁途径中的关键酶6-羟基假氧化尼古丁氧化酶（Pno）的电子传递及利用工程菌转化尼古丁生产6-羟基尼古丁进行了探究,具体内容如下:人工电子受体2,6-二氯酚靛酚（DCPIP）在实验室前期被用作Pno的电子受体测试了 Pno催化6-羟基假氧化尼古丁氧化脱氨的反应。为了方便实验,本论文首先尝试了 Pno对假氧化尼古丁（6-羟基假氧化尼古丁的类似物）的催化性质,并用其替代真正底物开展实验。进一步通过生化分析、遗传分析和LC-MS分析来确定Pno可利用电子转移黄素蛋白（EtfAB）作为生理电子受体催化假氧化尼古丁脱氨生成3-玻珀酰半醛吡啶。在此过程中,NAD（P）+、O2和铁氧还蛋白不能作为电子受体发挥作用。同时,利用18O标记的底物证实产物3-琥珀酰半醛吡啶中的醛基氧原子来自H2O。对尼古丁降解基因簇上etfAB基因的敲除降低了A.tumefaciens S33在尼古丁培养基中的生长速率,但其在HSP（6-羟基-3-玻珀酰吡啶,S33降解尼古丁杂合途径下游的一种中间代谢物）培养基中的生长情况没有受到明显影响,这表明EtfAB在菌株S33高效降解尼古丁的过程中起到了重要的作用。进一步的实验发现在电子转移黄素蛋白:泛醌氧化还原酶（Euo）的催化下,电子可从还原态EtfAB进一步转移到辅酶Q。这些结果有助于深入了解尼古丁氧化降解途径涉及的电子转移过程和能量代谢,为细菌分解代谢尼古丁提供了新见解。此外,实验室前期构建了敲除了 6-羟基尼古丁氧化酶Hno编码基因的工程菌S33-△hno,本论文利用该工程菌进行了将尼古丁转化为有价值的化合物6-羟基尼古丁的全细胞转化实验。在最适条件（30℃、pH 7.0、初始尼古丁浓度为1.0 g/l）下,以含0.1 g/1 HSP的葡萄糖铵盐培养基30℃培养24小时获得的细胞作为生物催化剂,进行分批转化和分批补料细胞转化反应实验。分批转化中每批次发酵的摩尔转化率达到95%;分批补料转化中最终摩尔转化率高达98.4%。回收产物的回收率为76.9%,产率可达83.9%。综上,本论文通过对EtfAB和Euo进行的异源表达、纯化和酶反应测定,发现Pno以EtfAB作为生理条件下的电子受体,且可进一步通过Euo的催化将电子转移到CoQ,进而沿ETC传递给02,该结果说明Pno是一个脱氢酶而非氧化酶,因此我们将Pno更名为6-羟基假氧化尼古丁脱氢酶。本研究完善了A.tumefaciens S33氧化降解尼古丁的“杂合途径”,同时也为深入了解细菌氧化降解尼古丁过程中的电子传递和能量代谢提供了新见解。本论文对尼古丁转化工程菌的应用,在为高值化合物6-羟基尼古丁的工业化生产提供了实验基础的同时,也为烟草废弃物的处理提供了一种新的绿色替代途径。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 本文缩略词对照表
• 第一章 前言
•   1 微生物降解尼古丁的途径
•   2 A.tumefaciens S33氧化降解尼古丁的研究进展
•   3 A.tumefaciens S33氧化降解尼古丁的应用
•   4 本论文研究内容
• 第二章 电子转移黄素蛋白EtfAB的异源表达及功能鉴定
•   1 实验材料与方法
•     1.1 实验材料
•     1.2 实验仪器
•     1.3 菌株及质粒
•     1.4 培养基和缓冲液
•     1.5 EtfAB的生物信息学分析
•     1.6 pET28b（+）-etfAB重组质粒的构建及异源表达和纯化
•     1.7 EtfAB的生化性质分析
•     1.8 EtfAB的功能鉴定
•     1.9 EtfAB编码基因缺失菌株的生长验证和qRT-PCR分析
•   2 结果与讨论
•     2.1 EtfAB的生物信息学分析
•     2.2 EtfAB的异源表达和纯化
•     2.3 假氧化尼古丁可作为Pno催化反应的底物
•     2.4 EtfAB参与Pno催化反应及反应产物的质谱鉴定
•     2.5 EtfAB编码基因缺失菌株的生长验证和qRT-PCR分析
•   3 本章小结
• 第三章 电子转移黄素蛋白:泛醌氧化还原酶（Euo）的异源表达及功能研究
•   1 实验材料与方法
•     1.1 实验材料
•     1.2 实验仪器
•     1.3 菌株及质粒
•     1.4 培养基和缓冲液
•     1.5 Euo的蛋白序列比对
•     1.6 pET28b（+）-euo重组质粒的构建及异源表达和纯化
•     1.7 Euo的生化性质分析
•     1.8 Euo的功能鉴定
•   2 结果与讨论
•     2.1 Euo的序列比对结果
•     2.2 Euo的异源表达及分离纯化
•     2.3 Euo参与反应的功能鉴定及反应产物的LC-MS鉴定
•   3 本章小结
• 第四章 尼古丁转化工程菌（S33-△hno）的应用
•   1 实验材料与方法
•     1.1 实验材料
•     1.2 实验仪器
•     1.3 菌株
•     1.4 培养基及缓冲液
•     1.5 休止细胞的制备
•     1.6 全细胞催化的分批转化和分批补料转化实验
•     1.7 产物收集及样品检测
•   2 结果与讨论
•     2.1 全细胞催化的分批转化和分批补料转化实验
•     2.2 产物检测
•   3 本章小结
• 结束语
• 参考文献
• 致谢
• 在读期间发表的论文
• 学位论文评阅及答辩情况表

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 王蓉水

导师: 王书宁

关键词: 羟基尼古丁,羟基假氧化尼古丁氧化酶,电子转移黄素蛋白

来源: 山东大学

年度: 2019

分类: 基础科学,工程科技Ⅰ辑

专业: 生物学,轻工业手工业,轻工业手工业,环境科学与资源利用,环境科学与资源利用

单位: 山东大学

分类号: X795;X172

总页数: 86

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