PGC7与其互作的RBBP4、HDAC1蛋白在Dlk1-Dio3印记区调控中的作用

论文摘要

PGC7又称Dppa3或Stella,是一个在早期胚胎发育过程中维持印记的母源效应因子,还是一个能通过调节印记基因表达促进细胞多能性维持及重编程过程发生的小蛋白。该蛋白在小鼠中只有150个氨基酸而且是一个非折叠结构的蛋白,能与多种具有功能的蛋白质结合来发挥功能。HDAC1/2-RBBP4/7复合物由去乙酰化酶HDAC1/2和组蛋白伴侣RBBP4/7组成,该复合物能与其他蛋白结合组成更大的蛋白复合物发挥功能。Dlk1-Dio3印记区是研究哺乳动物印记调控的理想模型,且参与干细胞水平以及多种疾病发病机理的细胞生物学过程,甚至该区域长非编码RNA是否正确表达可以判定诱导多能干细胞的全分化潜能。本研究分析PGC7蛋白质谱数据发现RBBP4为潜在的PGC7相互作用蛋白,首先确定了两者的互作及细胞内定位并通过ChIP-qPCR检测两者在Dlk1-Dio3基因簇主要甲基化调控区域IG-DMR的结合情况。进一步构建了稳定敲降RBBP4的小鼠F9细胞系,通过实时荧光定量PCR发现RBBP4敲降后会导致印记基因Dlk1、Meg3、Peg10和Rasgrf的mRNA水平表达显著下降。亚硫酸氢盐DNA甲基化测序检测发现RBBP4敲降后Dlk1-DMR和Meg3-DMR的DNA甲基化水平上升。免疫荧光染色发现RBBP4敲降后整体DNA甲基化水平无显著变化而H4乙酰化水平下降。为探究调控Dlk1-Dio3印记区时细胞多能性是否会受到影响,本研究对细胞进行维甲酸处理,实时定量PCR检测印记基因Dlk1、Meg3及细胞多能性相关基因Oct4、Nanog、Sox2和Pgc7的表达,结果维甲酸处理后印记基因Dlk1、Meg3表达显著上升,而多能性因子表达均显著下降。并且实时荧光定量PCR检测到RBBP4敲降后多能性基因Sox2、Oct4和Pgc7的表达水平降低。同时碱性磷酸酶染色和CCK细胞增殖试验确定了RBBP4敲降会减缓细胞增殖,加速细胞分化。RBBP4蛋白为一个组蛋白伴侣,参与形成HDAC1/2-RBBP4/7去乙酰化酶复合物。本研究构建了HDAC1/2-RBBP4/7复合物中HDAC1、HDAC2、RBBP7的真核表达载体,通过蛋白质免疫共沉淀技术确定PGC7还与HDAC1、HDAC2发生互作,且在加入PGC7蛋白后影响了HDAC1与HDAC2、HDAC1与RBBP4蛋白之间的互作。由于PGC7蛋白对HDAC1/2-RBBP4/7复合物互作的影响,本研究推测PGC7可能通过招募HDAC1在甲基化调控区发挥作用。通过染色质免疫共沉淀技术确定PGC7与HDAC1在Dlk1-Dio3印记区IG-DMR处共结合,干扰PCG7后HDAC1在该处的结合减少,由此推测PGC7与HDAC1在该区域可能存在协同调控。综上所述,本研究验证了PGC7蛋白分别能与HDAC1/2-RBBP4/7复合物中HDAC1、HDCA2和RBBP4蛋白互作并影响复合物之间的互作。并且,本研究进一步探究了RBBP4、HDAC1与PGC7在Dlk1-Dio3基因区的调控及RBBP4与PGC7对细胞增殖分化的影响,为进一步解释组蛋白去乙酰化-DNA甲基化、印记调控-细胞多能性的关系和印记紊乱现象提供理论依据。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 文献综述
•   1.1 PGC7蛋白研究进展
•     1.1.1 PGC7的基本生物特性
•     1.1.2 PGC7保护母源基因组和印记位点
•     1.1.3 PGC7促进细胞多能性维持
•     1.1.4 PGC7促进体细胞重编程
•   1.2 Dlk1-Dio3印记调控区
•   1.3 印记调控与细胞多能性
•   1.4 RBBP4蛋白研究进展
•   1.5 HDAC1/2-RBBP4/7蛋白复合物
•   1.6 组蛋白去乙酰化与DNA甲基化
• 第二章 RBBP4与PGC7互作验证及共定位分析
•   2.1 材料与方法
•     2.1.1 材料
•     2.1.2 主要仪器、试剂及溶液配制
•     2.1.3 方法
•   2.2 试验结果
•     2.2.1 目的片段扩增结果
•     2.2.2 PGC7与RBBP4互作验证结果
•     2.2.4 PGC7与RBBP4蛋白共定位分析
•   2.3 讨论
•   2.4 小结
• 第三章 PGC7与RBBP4对Dlk1-Dio3印记区的调控
•   3.1 材料与试剂
•     3.1.1 材料
•     3.1.2 主要仪器、试剂及溶液配制
•   3.2 试验方法
•     3.2.1 染色质免疫共沉淀（Chromatin Immunoprecipitation,Ch IP）
•     3.2.2 RBBP4稳定敲降小鼠F9细胞系获得
•     3.2.3 实时定量PCR（quantitative real-time PCR）
•     3.2.4 DNA甲基化检测（亚硫酸氢盐修饰后测序法）
•     3.2.5 碱性磷酸酶染色（Alkaline Phosphatase,AP染色）
•     3.2.6 CCK细胞增殖实验
•   3.3 试验结果
•     3.3.1 PGC7与RBBP4蛋白在Dlk1-Dio3印记区IG-DMR结合验证
•     3.3.2 RBBP4单等位基因敲除小鼠F9 细胞系鉴定
•     3.3.3 RBBP4敲降对印记基因表达影响
•     3.3.4 RBBP4敲降对Dlk1-DMR和Meg3-DMR甲基化影响
•     3.3.5 RBBP4敲降对整体DNA甲基化水平影响
•     3.3.6 RBBP4敲降对组蛋白H4乙酰化影响
•     3.3.7 RBBP4对细胞多能性的影响
•     3.3.8 RBBP4与PGC7对细胞增殖的影响
•   3.4 讨论
•   3.5 小结
• 第四章 PGC7对HDAC1/2-RBBP4/7复合物互作影响
•   4.1 材料与方法
•     4.1.1 材料
•     4.1.2 主要仪器、试剂及溶液配制
•     4.1.3 方法
•   4.2 试验结果
•     4.2.1 Hdac1、Hdac2、Rbbp7 基因PCR扩增
•     4.2.2 Hdac1、Hdac2、Rbbp7 真核表达载体双酶切验证
•     4.2.3 PGC7分别与HDAC1、HDAC2、RBBP7互作验证
•     4.2.4 PGC7加入对HDAC1/2-RBBP4/7复合物自身相互作用的影响
•   4.3 讨论
•   4.4 小结
• 第五章 PGC7与HDAC1对Dlk1-Dio3印记区的调控
•   5.1 材料与方法
•     5.1.1 材料
•     5.1.2 主要仪器、试剂及溶液配制
•     5.1.3 方法
•   5.2 结果
•     5.2.1 PGC7与HDAC1在小鼠F9 细胞中的定位
•     5.2.2 HDAC1在Dlk1-Dio3印记调控区IG-DMR结合情况
•     5.2.3 PGC7干扰对HDAC1在Dlk1-Dio3调控区IG-DMR结合影响
•     5.2.4 PGC7和HDAC1对Dlk1、Meg3表达影响
•   5.3 讨论
•   5.4 小结
• 全文总结
• 参考文献
• 附录A 引物序列
• 附录B 真核表达质粒载体骨架图谱
• 致谢
• 作者简介

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 柯洁

导师: 郭泽坤

关键词: 去乙酰化复合物,基因簇,印记调控与细胞多能性

来源: 西北农林科技大学

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学

单位: 西北农林科技大学

基金: 国家自然科学基金(编号:31872355)

分类号: Q344

总页数: 88

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