论文摘要
作为半导体荧光纳米材料,含镉量子点（Cd-QDs）具有优良的光学性能,如吸收光谱宽、荧光强度高、发射光谱窄、发光波长可调及抗光漂白等,这使得其在生物医学领域中有着广泛的应用。Cd-QDs在细胞内能够释放出Cd2+,显示出细胞毒性,其安全性问题限制了该类材料和技术的推广应用。Cd-QDs进入生物机体后,经血液循环系统分布到全身各器官（肝、肾、脾、心脏、淋巴结等）,引发多系统、多器官性的机体损伤。研究证实,外源污染物可在生物体内诱发氧化应激与免疫损伤效应,通过扰乱氧化还原平衡和免疫平衡进而诱发疾病。阐明细胞中Cd-QDs的毒性效应和机理及其Cd2+的释放情况,是早期防治含镉纳米材料对健康危害以及开发安全、性能优异Cd-QDs新材料的关键环节。Cd-QDs的生物毒性与其释放Cd2+密切相关,目前的研究由于缺乏细胞内Cd2+和Cd-QDs的原位检测,人们对Cd-QDs及其释放Cd2+的细胞毒性效应、作用机理知之甚少。为了研究细胞中Cd-QDs、Cd2+各自对细胞毒性贡献的大小,细胞内Cd-QDs及Cd2+的原位同时检测技术亟需完善。常用的测定Cd-QDs浓度的方法是朗伯比尔定律,该方法的灵敏度低,Cd-QDs浓度的测定依赖于研究者所选择的摩尔吸收系数,目前对于参数的选择尚未达成一致意见。另外,原子吸收及电感耦合等离子体质谱（ICP-MS）等方法对Cd2+及Cd-QDs含量的检测灵敏度高、技术成熟,多是消解后测定细胞内Cd2+、Cd-QDs的总量或两者的平均含量。但测定环境与细胞内差别甚大,影响了Cd2+、Cd-QDs含量测定和毒性研究的准确性与可靠性。相较于传统毒理学,纳米毒理学的研究更为复杂。同种纳米材料,选取不同的实验条件和研究对象都有可能得到不同的结论。Cd-QDs的种类繁多,合成方法多样,Cd-QDs暴露引起机体相关的毒性效应与作用机理仍存在争议,Cd-QDs原位释放Cd2+的机理尚未阐明,Cd-QDs和Cd2+的原位检测还需进一步建立和完善相关的研究方法。针对以上问题,本研究主要包括以下几个部分:1.以小鼠肝脏、肾脏细胞作为实验对象,通过流式细胞术原位检测了细胞内CdTe QDs与Cd2+的相对含量,研究了CdTe QDs释放Cd2+的机理;采用智能活细胞成像系统连续24小时观察了CdTe QDs进入细胞的过程。研究发现,相比于肝细胞,CdTe QDs进入肾细胞的数量更多,对肾细胞的毒性作用更大;CdTe QDs在肝肾细胞中均可释放出Cd2+,且存在动态平衡。此外,本研究从实验动物、细胞层面上检测了CdTe QDs暴露诱发肝脏、肾脏中氧化应激生物标记物的变化,结果表明CdTe QDs和Cd2+可诱发两种细胞产生氧化应激效应,CdTe QDs暴露打破了细胞内的氧化还原平衡,对肝、肾细胞造成了氧化损伤。2.以小鼠脾、淋巴细胞亚群-CD4+ T和CD8+ T细胞为研究对象,从细胞水平上研究了CdTe QDs对小鼠的免疫细胞的毒性效应与机理。细胞经CdTe QDs暴露后,初步分析了CdTe QDs对脾细胞活力的影响,利用流式细胞术分别测定了脾细胞内CdTe QDs及Cd2+的相对含量。研究结果表明,CdTe QDs对脾细胞产生了较高的细胞毒性,高浓度CdTe QDs（100 μM）暴露时,脾细胞的活力下降到78.4%（暴露时间为24 h）。脾脏活细胞中无游离的CdTe QDs存在,但脾脏死细胞中CdTe QDs浓度随着暴露浓度的增大而增多。CdTe QDs暴露后,随着浓度的增加,脾细胞中处于凋亡晚期的细胞比例上升、凋亡早期的细胞比例下降。此外,本部分还研究了CdTe QDs对小鼠CD4+T和CD8+T细胞的毒性作用。结果表明,CdTe QDs对两种免疫细胞均产生了细胞毒性作用。随着CdTe QDs暴露浓度的增加,小鼠CD4+ T和CD8+ T细胞的活力下降。CdTe QDs诱导小鼠CD4+ T和CD8+ T细胞发生凋亡。CdTe QDs暴露后,两种细胞中活细胞和处于早期凋亡的细胞比例降低,晚期凋亡的细胞比例升高。低剂量暴露情况下,活细胞占主要部分,随着暴露剂量和暴露时间的增加,凋亡早期和凋亡晚期的细胞占主要部分。3.以机体内重要功能蛋白-谷胱甘肽过氧化物酶3（Gpx3）、溶菌酶（LYZ）和褶皱假丝酵母脂肪酶（CRL）为研究对象,采用多光谱法、量热法、酶活性测定以及分子模拟等方法,研究了CdTe QDs对蛋白结构和功能的影响,以及不同体系的结合模式,模拟了CdTe QDs与蛋白的结合位点,结合上述动物、细胞实验,分子水平上探究CdTe QDs对蛋白的影响。结果表明:（1）CdTe QDs与Gpx3结合形成了新的复合物,其在动物、细胞和分子水平上均导致Gpx3酶活性发生下降。CdTe QDs与Gpx3的结合作用过程中范德华力与氢键作用力起主导作用,但结合力相对较弱。CdTe QDs使得Gpx3二级结构发生改变,Gpx3骨架发生了去折叠,CdTe QDs改变了Gpx3芳香族氨基酸残基的微环境。对接的结果表明,CdTe QDs进入Gpx3空腔并于Glu132发生相互作用,进一步使得Gpx3的酶活性下降。（2）CdTe QDs与LYZ发生相互作用形成了复合物,其优先结合于LYZ活性位点附近。结合过程中范德华力和氢键作用力占主导作用,Gpx3与LYZ酶活性中心的关键氨基酸发生作用,使得其活性随着CdTe QDs浓度的增加,受到的抑制性增强。（3）CdTe QDs静态猝灭了CRL的内源荧光,使其结构和功能都发生了变化。结合中疏水作用力占主导作用,结合力较强,结合位点位于酶活性中心。对接结果表明,CdTe QDs与CRL酶活性中心Ser-209及其周围的氨基酸发生作用,使得CRL酶活性降低。本研究结合动物、细胞和分子三个层面的毒性评价方法,评价了 CdTe QDs暴露诱发小鼠不同细胞氧化应激、免疫损伤相关毒性效应,探究了CdTe QDs释放Cd2+的机理并原位检测了细胞中两者的相对含量,建立了 CdTe QDs与重要功能蛋白的作用模型,为更好地理解CdTe QDs的生物毒性提供了基础数据;为评估含镉重金属污染物及纳米颗粒的危害提供了科学的参考依据和技术支持。
论文目录
文章来源
类型: 博士论文
作者: 赵立宁
导师: 刘汝涛
关键词: 镉离子,氧化应激,免疫器官,蛋白结构与功能
来源: 山东大学
年度: 2019
分类: 基础科学,工程科技Ⅰ辑
专业: 生物学,环境科学与资源利用
单位: 山东大学
基金: 国家自然科学基金(21277081,21477067),高等学校博士学科点专项科研基金(20130131110016),高等学校科技创新工程重大项目培育资金项目(708058),山东省科技计划项目(2014GSF117027)
分类号: X171.5
总页数: 122
文件大小: 19422K
下载量: 201