Gspt1l在斑马鱼肝脏发育中的功能研究

论文摘要

肝脏是脊椎动物特有的器官,在糖代谢、脂代谢、蛋白质代谢、毒物代谢中发挥着重要作用。肝脏的发育在时空上受到严格的调控,近年来肝脏发育的研究使人们对于肝细胞命运决定和肝细胞分化的分子机制有了更深入的了解,为肝病的治疗提供了重要的理论依据。斑马鱼具有体外发育、胚胎透明、胚胎量大以及发育时间短的优势,已经成为研究胚胎早期发育的理想模式动物,而且调控肝脏发育的分子机制在人类和斑马鱼之间是保守的。斑马鱼肝脏的发育可以大致分为特化（Specification）、出芽（Budding）、生长（Outgrowth）等时期,虽然很多研究揭示了调控肝脏特化以及出芽的分子机制,但肝脏生长和分化过程中分子机制的研究是不完善的。斑马鱼gspt1l（G1 to S Phase Transition 1,like）是人类GSPT1/eRF3α（真核肽链释放因子GTP结合亚基3α,Eukaryotic Peptide Chain Release Factor GTP-binding subunit 3α）的同源基因,属于小GTPase家族。GSPT1通过结合GTP激活真核翻译终止因子1（Eukaryotic Translation Termination Factor 1,eRF1）促进肽链翻译的终止。有研究表明GSPT1还通过参与14-3-3蛋白和凋亡信号调节激酶1（Apoptosis Signal Regulating Kinase 1,ASK1）复合体的解聚诱发细胞凋亡。GSPT1缺失导致细胞周期G1期（Gap 1 phase）停滞,细胞质中未结合mRNA的核糖体亚基增多。在斑马鱼中gspt1l突变会导致胚胎致死,并在发育过程中出现血管增生。正向遗传学筛选是一种发现新颖基因的重要手段,在之前的研究中我们利用ENU（N-ethyl-N-nitrosourea）随机诱变后筛选得到了一系列的肝脏发育缺陷型家系。其中v28突变体中肝脏以及外分泌胰腺、肠道祖细胞特化和出芽正常但生长被抑制,而且v28突变体中肝脏分化基因lfabp、gc的表达延迟,表明肝细胞分化被抑制。通过图位克隆我们发现在v28突变体中gspt1l基因发生了无义突变。并且注射gspt1l野生型的mRNA可以部分挽救v28突变体的肝脏表型,说明gspt1l是v28的突变基因。gspt1l在肝脏、外分泌胰腺、肠道中有表达,这也和v28突变体中消化器官缺陷的表型是相吻合的。为了研究gspt1l在消化器官发育中的作用首先我们通过细胞增殖和凋亡实验证明了gspt11v28突变通过降低细胞增殖速度影响了肝脏的生长。有文献报道斑马鱼gspt1l突变可以激活内质网未折叠蛋白应答（Unfolded Protein Response,UPR）进而使脑血管发育畸形。UPR主要通过ATF6（Activating Transcription Factor 6）、PERK（Double-Stranded RNA-activated Protein Kinase（PKR）–like ER Kinase）、IRE1（Inositol Requiring Enzyme 1）三条通路调控内质网压力（ER stress）条件下细胞的应激反应,在ER stress前期阶段UPR主要促进细胞生存,当ER stress持续损害细胞时UPR转而促进细胞凋亡。在体外研究中人们发现具有促进细胞生存的ATF6、IRE1通路活性在ER stress第二阶段会逐渐衰减,而我们发现在gspt11v28突变体中IRE1通路活性不会发生衰减。而且ER stress的抑制剂TUDCA（Sodium Tauroursodeoxycholate）可以降低gspt11v28突变体中IRE1通路的活性并部分挽救肝细胞分化延迟的表型,但对肝脏及其他消化器官的增殖缺陷没有作用。为了进一步证明是否IRE1通路的活性是影响肝细胞分化的原因,我们进一步使用Ire1α的特异性抑制剂STF-083010,但我们发现STF-083010不能挽救肝细胞分化延迟的表型。以上结果表明gspt1l对于斑马鱼肝脏及其他消化器官的发育是必须的,gspt11v28突变通过UPR抑制肝脏的分化,而且可能是不依赖Ire1αRNase活性的。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第1章 文献综述
•   1.1 斑马鱼模式动物的优势
•   1.2 斑马鱼肝脏的发育
•     1.2.1 斑马鱼肝脏的形态发生
•     1.2.2 斑马鱼肝脏发育的分子调控机制
•   1.3 斑马鱼胰腺的发育
•     1.3.1 斑马鱼胰腺的形态发生
•     1.3.2 斑马鱼胰腺发育的分子调控机制
•   1.4 未折叠蛋白应答（Unfolded Protein Response,UPR）
•     1.4.1 激活转录因子6（ATF6）信号通路
•     1.4.2 蛋白激酶R样内质网激酶（PERK）信号通路
•     1.4.3 肌醇依赖性激酶1（IRE1）信号通路
•   1.5 Gspt1l的功能研究
• 第2章 材料与方法
•   2.1 实验动物及饲养
•   2.2 实验仪器、试剂、耗材
•   2.3 相关试剂的配制
•     2.3.1 斑马鱼及胚胎养殖
•     2.3.2 原位杂交相关试剂
•     2.3.3 LB培养基
•     2.3.4 DNA琼脂糖凝胶电泳相关试剂
•     2.3.5 Western Blot相关试剂
•     2.3.6 其他
•   2.4 实验方法
•     2.4.1 基因组DNA提取
•     2.4.2 定位克隆
• v28突变体基因型鉴定'>    2.4.3 gspt1l^v28突变体基因型鉴定
•     2.4.4 斑马鱼胚胎总RNA提取
• TMⅡ First Strand cDNA Synthesis Kit)'>    2.4.5 cDNA合成(BeyoRT^TMⅡ First Strand cDNA Synthesis Kit)
•     2.4.6 Real-Time QPCR
•     2.4.7 质粒的构建
•     2.4.8 反义RNA探针的合成
•     2.4.9 全胚原位杂交
•     2.4.10 mRNA合成及胚胎显微注射
•     2.4.11 斑马鱼胚胎总蛋白提取
•     2.4.12 Western Blot
•     2.4.13 全胚抗体染色
•     2.4.14 切片抗体染色
• 第3章 实验结果
•   3.1 引言
•   3.2 v28突变体中消化器官发育被抑制
•   3.3 v28突变体中的消化器官发育缺陷是由于gspt1l突变引起的
•   3.4 gspt1l突变抑制肝细胞的增殖及分化
• v28突变引起的肝细胞分化缺陷'>  3.5 TUDCA部分挽救gspt1l^v28突变引起的肝细胞分化缺陷
•   3.6 结论
• 第4章 讨论与分析
• 参考文献
• 致谢

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 韩新卢

导师: 黄红辉

关键词: 斑马鱼,肝脏发育

来源: 西南大学

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学

单位: 西南大学

分类号: Q418

总页数: 65

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