地衣芽孢杆菌GH48家族外切纤维素酶CelA的异源表达和功能研究

论文摘要

近年来资源危机的加剧使得人们对生物能源的需求急剧增加,木质纤维素作为最丰富的生物质资源,其生物转化研究备受关注。纤维素酶特别是进行性外切纤维素酶被认为是生物转化酶系的重要组成部分,对转化速率具有重要影响。本研究对来源于地衣芽孢杆菌的GH48家族外切纤维素酶CelA进行了基因克隆和异源表达,并对该酶的酶学性质和相关功能残基进行了研究,还探讨了CBM结构域对CelA催化特性的影响。具体研究内容及结果如下:（1）外切纤维素酶CelA的基因克隆及异源表达对来源于地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis ATCC14580）的外切纤维素酶CelA进行了序列分析,结果显示该酶包含704个氨基酸,没有明显的信号肽和跨膜区,只有一个隶属于GH48家族的功能域。利用在线软件对CelA进行了同源建模,结果显示CelA具有GH48家族酶典型的（α/α）6桶形折叠,进一步确定CelA为GH48家族纤维素酶。利用同源扩增的方法从Bacillus licheniformis ATCC14580基因组中克隆了celA基因,并转化至E.coli Rosetta（DE3）中进行了异源表达,利用亲和层析纯化出目的重组蛋白。（2）CelA催化特性的研究底物特异性测定结果显示CelA以再生无定形纤维素RAC为底物时酶活力最高,其最适反应pH值为9.0,最适反应温度为50℃,具有较好的温度和pH稳定性。Mn2+和低浓度的Na+、Fe2+、Fe3+对重组酶的酶活力有促进作用;K+、Ca2+、Mg2+、Zn2+、Cu2+、Co2+、Ni2+对酶活有抑制作用。甲醇、乙醇、异丙醇、β-巯基乙醇、吐温-80、triton X-100、EDTA和高浓度的甘油使酶活力明显下降,PMSF、尿素和低浓度的甘油对酶活力没有显著影响。CelA水解纤维寡糖的最小底物为纤维四糖,水解产物为二糖分子,水解纤维五糖的产物为二糖和三糖,是一种纤维二糖水解酶。（3）CelA功能位点的研究根据序列及结构分析结果,确定了可能与CelA功能相关的催化残基、底物结合残基及隧道末端环残基,利用定点突变技术对这些位点的功能进行了研究。结果显示E38、E49和D228是CelA的催化活性残基,其中E49为质子供体,D228为催化碱,而E38在CelA的水解过程中也起到重要作用,突变体E38A、E49A和D228N的酶活性仅为野生型的10%左右。Y100、W312和T107是隧道入口或隧道内可能与底物结合相关的残基,突变体Y100A、T107A及W312A的酶活性分别为野生型的34%、59%和28%,这些残基可能参与对糖链进入活性位点的引导,其中芳香族残基起到的作用更大。末端环上的氨基酸残基E591、E592突变为具有小侧链的丙氨酸后,剩余酶活分别为野生型的48%和51%,说明末端环的灵活性对产物释放影响不大,可能通过与产物产生氢键引导它们排出裂隙。（4）CBM结构域对CelA催化特性的影响利用融合PCR技术将CelA催化结构域与碳水化合物结合结构域CBM串联,重组的杂合酶活性急剧下降,仅为野生型的9.8%,酶的最适反应温度及最适反应pH值没有改变,但稳定性下降。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 前言
•   1.1 纤维素
•     1.1.1 纤维素的发现与命名
•     1.1.2 纤维素的结构
•     1.1.3 纤维素的来源与应用
•   1.2 纤维素酶
•     1.2.1 纤维素酶的应用
•     1.2.2 纤维素酶的来源
•     1.2.3 纤维素酶的组成
•     1.2.4 纤维素酶的分类
•     1.2.5 纤维素酶的结构
•     1.2.6 纤维素酶的作用机制
•   1.3 地衣芽孢杆菌
•   1.4 立题依据及研究内容
• 第二章 CelA的异源表达和酶学性质研究
•   2.1 引言
•   2.2 实验材料
•     2.2.1 实验菌株和质粒
•     2.2.2 实验试剂及工具酶
•     2.2.3 培养基和缓冲液
•     2.2.4 仪器设备
•   2.3 实验方法
•     2.3.1 序列分析和同源建模
•     2.3.2 重组酶的构建
•     2.3.3 重组酶的表达与纯化
•     2.3.4 蛋白浓度的测定
•     2.3.5 再生无定型纤维素（RAC）的制备
•     2.3.6 3,5-二硝基水杨酸比色法（DNS法）测定纤维素酶活力
•     2.3.7 重组酶底物特异性的检测
•     2.3.8 重组酶最适反应pH、最适反应温度、pH稳定性及温度稳定性测定
•     2.3.9 金属离子对酶活性的影响
•     2.3.10 化学试剂对酶活性的影响
•     2.3.11 CelA降解寡糖的产物分析
•   2.4 实验结果及讨论
•     2.4.1 序列分析和同源建模
•     2.4.2 重组菌株的构建与筛选
•     2.4.3 重组酶的表达与纯化
•     2.4.4 重组酶的底物特异性
•     2.4.5 重组酶最适反应温度、最适反应pH、温度稳定性及pH稳定性
•     2.4.6 金属离子对酶活性的影响
•     2.4.7 化学试剂对酶活的影响
•     2.4.8 CelA降解寡糖的产物分析结果
•   2.5 小结
• 第三章 CelA功能位点的研究
•   3.1 引言
•   3.2 实验材料
•     3.2.1 实验菌株和质粒
•     3.2.2 实验试剂及工具酶
•     3.2.3 培养基和缓冲液
•     3.2.4 仪器设备
•   3.3 实验方法
•     3.3.1 序列比对
•     3.3.2 突变体的构建
•     3.3.3 突变体的诱导表达及纯化
•     3.3.4 蛋白浓度的测定
•     3.3.5 CelA与各突变体的纤维素酶活力测定
•   3.4 结果及讨论
•     3.4.1 催化氨基酸的研究
•     3.4.2 底物结合位点氨基酸的研究
•     3.4.3 隧道末端环氨基酸的研究
•   3.5 小结
• 第四章 底物结合域CBM的添加对CelA功能的影响
•   4.1 引言
•   4.2 实验材料
•     4.2.1 实验菌株和质粒
•     4.2.2 实验试剂及工具酶
•     4.2.3 培养基和缓冲液
•     4.2.4 仪器设备
•   4.3 实验方法
•     4.3.1 重组突变体的构建
•     4.3.2 重组突变体的诱导表达及纯化
•     4.3.3 重组突变体酶活性测定
•     4.3.4 重组突变体的最适反应温度与温度稳定性的测定
•     4.3.5 重组突变体的最适反应pH与pH稳定性的测定
•   4.4 实验结果及讨论
•     4.4.1 重组突变体的构建
•     4.4.2 重组突变体的诱导表达及纯化
•     4.4.3 CBM对CelA活性的影响
•     4.4.4 CBM对CelA酶学性质的影响
•   4.5 小结
• 总结及展望
• 参考文献
• 致谢

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 郎立新

导师: 李凡

关键词: 纤维素酶,家族,催化特性,功能位点

来源: 东北师范大学

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学,生物学

单位: 东北师范大学

分类号: Q78;Q936

总页数: 80

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