吕志祥(江苏省丹阳市人民医院212300)
【摘要】利用MALDl-TOF技术进行蛋白质组学研究是目前较为常见的研究方法，具有灵敏度高、工作量小、时间少等优点。本文简要介绍了该技术这几年的发展和应用。
【关键词】MALDl-TOF、蛋白质组学、质谱、肿瘤
【中图分类号】R319【文献标识码】A【文章编号】2095-1752（2013）05-0093-02
利用质谱进行蛋白质组学研究是近年兴起的、较为有效的研究方法，特别是对于发现潜在的生物标志物，用以鉴别健康与疾病具有重大意义[1-2]。基质辅助激光解吸电离飞行时间(MADLI-TOF)质谱技术在用于发现生物标志物方面国内外均有报道，他们与以往的双向电泳、多维液相色谱技术不一样，灵敏度更高，工作量小，也更节省时间。关于这项技术最早的报道是鉴别癌症，例如对癌症的鉴别包括卵巢癌、前列腺癌、乳房癌和肺癌等，并且因为结果的高灵敏度和特异度引起轰动。
一、MALDl-TOF技术的发展
飞行时间质谱(TOF)作为质量分离器的一种在上世纪70年代以前就已提出，具有结构简单，测定质量范围宽等特点，目前使用的TOF分为直线型和反射型。将MALDI离子化技术和TOF质谱技术结合的MALDI-TOF质谱技术具有操作简单，灵敏度高，质量分辨率高，测定质量范围宽等特点，非常适合生物分子和高聚物的分子量测定，因此随着生命科学的发展，MALDl-TOF技术亦得到长足进步。[4-6]
二、MALDl-TOF技术不同蛋白组学中的应用
1.对肿瘤癌细胞在分子水平进行诊断和治疗
在过去的十年之间，MALDI-TOF质谱分析已成为癌症研究的一个常用的工具，虽多与蛋白质分析有关仍单独阐述。这项技术的高吞吐量和相对简单的依靠血清/血浆就能获得生物标志物的和进行验证对科研工作者十分有吸引力。利用MALDI-TOF质谱进行血浆/血清分析，包括蛋白质芯片SELDI-TOF质谱分析，血清磁珠纯化，质量光谱免疫分析已经制定了许多技术方法。以肾细胞癌症患者为例，癌组织和周边的正常肾组织中存在差异表达的蛋白分子，就可以运用MALDI-TOF质谱对差异表达的蛋白质标记点进行了鉴定，随后经过二维电泳分离样本即可发现差异表达的蛋白质点。用MALDI-TOF还可以对这些点进行分析鉴定以确定了他们的种类找出与细胞病变相关的关键蛋白。[8]
Wilmet等人发现在乳腺癌细胞内，神经营养因子受体p75（NTR）作为一个促生存因子能够刺激细胞抗凋亡效应，但其作用机制仍然不完全明确。通过调查全球范围内的数据，P75（NTR）的过度表达会引起细胞内蛋白组发生修饰，这种改变同促凋亡剂肿瘤坏死因子（TNF）相关。结果数据表明，P75（NTR）的过度表达诱导产生乳腺癌细胞蛋白质组的修改，并提供有助于受体在肿瘤细胞内抗凋亡的信息。
另一方面，利用MALDI-TOF质谱对乳腺癌进行蛋白组学调查发现分子中存在异常的DNA甲基化使得肿瘤抑制基因（TSGs）和microDNA在自身抗癌活动过程中保持沉默，因此可以再分子水平通过去甲基化治疗乳腺癌成为可能，同时这种方法还能为其他的肿瘤治疗提供额外的途径。
2.在糖肽类分析中的应用
糖基化是一种普遍的蛋白质翻译后的修饰反应，在生命过程中起着重要作用。糖蛋白上的寡糖链能够影响蛋白的稳定性及蛋白的构象，参与胞外胞内的信号转导，并能引发与其它分子之间特异的相互作用。MADLI-TOF质谱以其简单、快速和较高的灵敏度已经成为糖结构分析中的重要手段。但是，由于寡糖的亲水性强，缺乏易于结合质子的碱性基团，离子化效率较低，使得MALDI-TOF质谱对寡糖链结构的分析远远落后于对蛋白／肽段的结构分析。为提高寡聚糖在质谱中的检测灵敏度，研究者进行了各种尝试，主要通对寡糖的化学修饰来提高寡糖的质谱检测灵敏度。如在寡聚糖的还原端通过衍生化加上各种结构中含有质子的基团(如季铵碱和吡啶)，或加上易得质子的基团(如胍基)；通过增强寡聚糖的疏水性来提高其检测灵敏度，因为疏水性强的分析物更容易与基质形成均匀的混晶从而产生更强的信号，如将苯肼、菇酪基团标记在寡聚糖的还原端从而提高寡聚糖在质谱中的检测灵敏度。[9]
MALDI-TOF质谱在糖类中的应用常常和其他分析手段相结合，例如通过免疫荧光检测DSA结合型糖蛋白在人正常肝细胞chang’sliver中的表达和定位。从人健康肝组织及肝癌组织中提取总蛋白，通过蔓陀萝凝集素(DSA)亲和柱层析分离和浓集DSA结合型糖基化蛋白质，分别通过双向电泳、糖蛋白染色复合总蛋白染色、基质辅助激光解吸飞行时间串联质谱(MALDI-TOF-MS／MS)技术及通过二维色谱(2D-LC)、纳升级电喷雾质谱(nESI-MS)技术对于亲和层析所获得的DSA结合型糖蛋白进一步的分离和鉴定，即能建立人健康肝组织及肝癌组织DSA结合型糖基化蛋白数据库。[10]
三、MALDl-TOF技术最新进展和结语
为了满足蛋白质组研究的需要，近年来，出现两种基于MALDI源的新型生物质谱仪。一种是改造现有的MALDI-TOF-MS，使其具有串联质谱的功能，如Bruker的ultmflex和ABI的4700MALDITOF—TOF串联质谱仪。BrukerUhraflex采用专利的LIFF技术，使源后裂解的离子能量归一化，一步即可测得MS-MS全谱(autoflexMALDITOF十多步才能完成一次PSD测量)。ABl4700在其直线(in—line)飞行管内增加一个高能碰撞室(collisioncell)，碰撞室与MALDI源之间的飞行管形成第一个TOF，碰撞室与其后的飞行管形成第二个TOF。改进后的MALDI—TOF不仅能检测蛋白质的肽谱，同时由可以检测肽序列，成为科学家在人类后基因组学研究中的有力工具。另一种克服MALDI脉冲离子源和连续质量分析器连接的技术瓶颈，研制出基于MALDI源的QqTOF(四极与飞行时间质谱串联的杂交质谱仪)串联质谱上。这两种质谱仪都能既保留原有仪器的特点，同时又兼顾蛋白质组研究测谱和测序的要求，是很有发展的两种新型生物质谱仪。[11]蛋白质组研究中所必须的高通、大规模筛选分析方法，为MALDI-TOF生物质谱施展才华提供一个大舞台，由于MALDI-TOF的肽质量指纹法(peptideMassFingerprintingPMF)具有高通量、高灵敏、制样简单、操作方便、简单可靠和易于自动化等优点，已经得到广泛的应用，并与ESI—QqTOV(电喷雾四极与飞行时间杂交串联质谱)、双向电泳、图像处理和生物信息学等一并成为蛋白质组研究的支柱技术。[12]
参考文献
[1]EtzioniR,UrbanN,RamseyS,etal.Thecaseforearlydetection[J].NatRevCancer,2003,3:243-252.
[2]AldredS,GrantMM,GriffithsHR.Theuseofproteomicsfortheassessmentofclinicalsamplesinresearch[J].ClinBiochem,2004,37:943-952.
[3]KoopmannJ,ZhangZ,WhiteN,etal.Serumdiagnosisofpancreaticadenocarcinomausingsurface-enhancedlaserdesorptionandionizationmassspectrometry[J].ClinCancerRes,2004,10:860-868.
[4]CornettDS，ReyzerML，ChaurandP，CaprioliRM.NatureMethods，2007，4(7)：828—833.
[5]AtkinsonSJ，LoadmanPM，SuttonC，PattersonLH，ClenchMR.RapidCommunMassSpectrom。2007(21)：1271—1276.
[6]PevsnerPH，eta1.RapidCommunMassSpeetrom，2007(21)：429—436.
[7]KarpovaMA,MoshkovskiiSA,ToropyginIY,ArchakovAI.Cancer-specificMALDI-TOFprofilesofbloodserumandplasma:biologicalmeaningandperspectives.JProteomics.2010Jan3;73(3):537-51.
[8]孙传洋,臧亚晨,孙伟,陈岽,朱进,许立军,章良,薛波新,阳东荣,单玉喜.用蛋白组学法筛选肾透明细胞癌潜在标记物.中华实验外科杂志，2010（27）:312-314.
[9]ZhangY,1wamotoT,RadkeG，KariyaY,SuzukiK,ConradAH,TomichJM,ConradGW,MassSpectrom.2008,43(6):765—772.
[10]孙强玲.人肝脏相关ConA和DSA结合型糖蛋白组学研究.2007年博士学位论文.
[11]朱良漪.分析仪器手册，北京：化学工业出版社，1997.
[12]赵晓光,薛燕,刘炳玉.MALDI-TOF质谱仪关键技术及进展.仪器评介，2004（3）:17-20.