白沙蒿病毒诱导基因沉默体系的探索与建立

论文摘要

白沙蒿（Artemisia sphaerocephala）为菊科蒿属沙生灌木,对荒漠生态系统的维持和恢复具有重要意义,同时其富含亚油酸、维生素E等,具有一定保健功效。随白沙蒿转录组测序的完成,对该物种基因功能的认知迫切。病毒诱导的基因沉默（Virus-induced gene silencing,VIGS）技术不需建立遗传转化体系,可快速验证植物基因功能,在非模式植物中被广泛应用。PDS（Phytoene desaturase,PDS）基因是合成类胡萝卜素的关键基因,该基因被沉默导致叶绿素合成途径被阻断,植物呈易分辨的“光漂白”表型,是探索VIGS体系的首选基因。本研究以白沙蒿为材料,选用烟草脆裂病毒（Tobacco rattle virus,TRV）为载体,PDS为目标基因,构建正反向重组载体。以注射法（Injection method,I）、真空渗透（Vacuum infiltration,V）、真空渗透+超声波（Vacuum infiltration+ultrasonic,V+U）三种接种方法,OD600=0.5、0.8、1.0、1.5四种菌液浓度,将含有重组载体的农杆菌菌液对子叶期和真叶期幼苗分别各处理24组,探索VIGS体系在白沙蒿中的可行性。主要结果如下:（1）克隆得到441 bp白沙蒿PDS基因片段AsPDS-F和AsPDS-R,构建出TRV病毒的正反向重组载体pTRV2-AsPDS-F、pTRV2-AsPDS-R。（2）子叶期VIGS体系建立受接种方法、菌液浓度和靶基因插入方向的极显著影响。子叶期VIGS体系最佳处理组为V+U-1.5-R,白化程度达0.72,白化部位在第一、二对真叶处。（3）真叶期白沙蒿VIGS体系的建立,分别受接种方法和菌液浓度极显著和显著影响,靶基因插入方向对体系的建立无影响。真叶期白沙蒿VIGS最佳处理组为I-1.5-R,其白化程度为0.34,白化部位在第三、四对真叶处。（4）子叶期白沙蒿VIGS体系中14组处理产生阳性植株,白化程度总均值为0.15;真叶期5组处理产生阳性植株,白化程度总均值为0.05。子叶期产生的阳性植株和白化程度均优于真叶期。本研究在白沙蒿中建立了快速、高效的功能基因沉默体系,为后续该物种的基因功能研究提供了技术支撑。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 缩写词表
• 第一章 绪论
•   1.1 引言
•   1.2 国内外研究进展
•     1.2.1 病毒诱导基因沉默体系的提出
•     1.2.2 病毒诱导基因沉默体系的作用机制
•     1.2.3 病毒诱导基因沉默体系的影响因素
•     1.2.4 病毒诱导基因沉默体系的应用
•     1.2.5 病毒诱导基因沉默体系的优缺点
•   1.3 研究目的意义及技术路线
•     1.3.1 研究目的意义
•     1.3.2 技术路线
• 第二章 材料与方法
•   2.1 材料与试剂
•     2.1.1 植物材料
•     2.1.2 病毒载体及菌株
•     2.1.3 主要试剂
•     2.1.4 试验仪器
•   2.2 试验方法
•     2.2.1 白沙蒿重组载体的构建
•     2.2.2 白沙蒿的侵染
• 第三章 结果与分析
•   3.1 重组载体的构建
•     3.1.1 AsPDS-F、AsPDS-R基因的获得
•     3.1.2 重组载体在大肠杆菌中的检测
•     3.1.3 重组载体在农杆菌中的检测
•   3.2 子叶期白沙蒿VIGS体系的探索与建立
•     3.2.1 不同处理对子叶期白沙蒿成活率的影响
•     3.2.2 不同处理下子叶期白沙蒿表型变化
•     3.2.3 不同处理对子叶期白沙蒿白化率的影响
•     3.2.4 不同处理对子叶期白沙蒿白化程度的影响
•     3.2.5 不同处理对子叶期白沙蒿叶绿素含量的影响
•     3.2.6 子叶期白沙蒿VIGS体系建立的三因素分析
•   3.3 真叶期白沙蒿VIGS体系的探索与建立
•     3.3.1 不同处理对真叶期白沙蒿成活率的影响
•     3.3.2 不同处理下真叶期白沙蒿表型变化
•     3.3.3 不同处理对真叶期白沙蒿白化率的影响
•     3.3.4 不同处理对真叶期白沙蒿白化程度的影响
•     3.3.5 不同处理对真叶期白沙蒿叶绿素含量的影响
•     3.3.6 真叶期白沙蒿VIGS体系建立的三因素分析
• 第四章 讨论
•   4.1 重组载体的高效构建
•   4.2 接种方法、菌液浓度、靶基因插入方向对子叶期白沙蒿VIGS体系的影响
•     4.2.1 接种方法对子叶期白沙蒿VIGS体系的影响
•     4.2.2 菌液浓度对子叶期白沙蒿VIGS体系的影响
•     4.2.3 靶基因插入方向对子叶期白沙蒿VIGS体系的影响
•   4.3 接种方法、菌液浓度、靶基因插入方向对真叶期白沙蒿VIGS体系的影响
•     4.3.1 接种方法对真叶期白沙蒿VIGS体系的影响
•     4.3.2 菌液浓度对真叶期白沙蒿VIGS体系的影响
•     4.3.3 靶基因插入方向对真叶期白沙蒿VIGS体系的影响
• 第五章 结论与展望
•   5.1 结论
•   5.2 展望
• 参考文献
• 在学期间研究成果
• 致谢

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 高红娟

导师: 张丽静

关键词: 白沙蒿,病毒诱导的基因沉默

来源: 兰州大学

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学,生物学

单位: 兰州大学

分类号: Q943.2

总页数: 58

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