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HOXC10启动子区域G-四链体结构的鉴定及功能的研究

2020-12-08阅读(861)

HOXC10启动子区域G-四链体结构的鉴定及功能的研究

论文摘要

作为Homeobox家族中的一员,HOXC10在哺乳动物的细胞分化和胚胎发育中起着重要的作用。越来越多的证据表明HOXC10在肿瘤的发生发展中具有调节作用,但关于HOXC10基因自身的表达调节相对被忽略。在本研究中,我们发现在HOXC10启动子的反义链上存在多个连续的鸟嘌呤序列,并且利用G-四链体预测网站发现每个多鸟嘌呤序列之间具有较高的形成G-quadreplex（G-四链体）结构的潜力。针对有高潜力形成G-四链体的区域利用化学合成方法体外合成该区域对应的寡核苷酸单链,通过圆二色谱实验分析并确定该区域存在的多个连续的鸟嘌呤序列在特定的波长处呈现G-四链体结构所展现的特定摩尔椭圆率,明确了 HOXC10启动子区域存在G-四链体结构。进一步通过非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳展示该区域在一定浓度的氯化钾溶液中能够形成分子内的G-四链体结构。将寡核苷酸单链用转染试剂转入人的宫颈癌HeLa细胞中,用G-四链体的抗体BG4做免疫荧光检测到荧光信号,证实寡核苷酸单链在癌细胞自身内环境中也可以形成G-四链体结构。将HOXC10转录起始位点上游2 000 bp的核苷酸序列通过PCR方法克隆到高斯荧光素酶报告载体中,并将能够形成G-四链体结构的区域进行点突变或缺失突变,将不同的报告载体转染到HeLa细胞中,利用发光底物检测高斯荧光素酶表达情况。结果显示G-四链体结构缺失或突变能够改变HOXC10启动子下游的高斯萤光素酶表达。据已报道文献记载,G-四链体结构的打开需要解旋酶的调控,本研究分析了759个乳腺癌病人样本,发现具有DNA解旋酶活性的染色质重塑蛋白CHD7与HOXC10基因的表达呈正相关,通过荧光素酶报告载体及CHD7表达干扰实验发现解旋酶CHD7能够解开HOXC10启动子中的G-四链体结构并增强其基因表达。综上实验结果,HOXC10启动子的G-rich区域能够形成G-四链体结构,并且能够被解旋酶CHD7解旋进而调控HOXC10基因表达。

论文目录

  • 摘要
  • Abstract
  • 1 绪论
  •   1.1 HOX基因概述
  •     1.1.1 HOX基因与癌症
  •   1.2 G-四链体结构概述
  •     1.2.1 G-四链体结构的功能
  •     1.2.2 G-四链体结构与解旋酶
  •   1.3 本论文的研究内容及其研究目的
  •     1.3.1 研究内容
  •     1.3.2 研究目的
  • 2 实验材料与实验方法
  •   2.1 实验材料与实验仪器
  •     2.1.1 实验材料
  •     2.1.2 实验仪器
  •     2.1.3 实验试剂的配置
  •   2.2 实验方法
  •     2.2.1 细胞培养与瞬时转染
  •     2.2.2 shRNA表达载体的构建
  •     2.2.3 基因组DNA提取与模板处理
  •     2.2.4 圆二色谱分析
  •     2.2.5 免疫荧光检测G-四链体结构
  •     2.2.6 非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）和DNA银染
  •     2.2.7 凝胶迁移分析
  •     2.2.8 引物的设计
  •     2.2.9 慢病毒包装与侵染
  •     2.2.10 实时定量PCR（RT-qPCR）检测基因表达水平
  •     2.2.11 Gluc荧光素酶活性检测
  •     2.2.12 Secreted Alkaline Phosphatase （SEAP）检测
  •     2.2.13 DNA复制停滞实验检测G-四链体结构
  •     2.2.14 CHIP实验
  • 3 实验结果
  •   3.1 G-四链体结构的预测与鉴定
  •     3.1.1 G-四链体结构预测
  •     3.1.2 G-四链体结构的鉴定
  •   3.2 荧光素酶报告载体构建
  •   3.3 G-四链体结构通过抑制DNA合成抑制HOXC10基因表达
  •   3.4 解旋酶CHD7能够打开G-四链体结构
  •     3.4.1 CHD7解旋酶调控外源HOXC10基因的表达
  •     3.4.2 CHD7解旋酶调控内源HOXC10基因的表达
  •   3.5 解旋酶CHD7与HOXC10启动子直接结合调控基因表达
  •   3.6 本章小结
  • 讨论
  • 结论
  • 参考文献
  • 附录
  • 攻读学位期间发表的学术论文
  • 致谢

    • 文章来源

    类型: 硕士论文

    作者: 张晓

    导师: 隋广超

    关键词: 四链体结构,解旋酶,荧光素酶报告载体,基因表达

    来源: 东北林业大学

    年度: 2019

    分类: 基础科学

    专业: 生物学,生物学

    单位: 东北林业大学

    基金: 国家自然科学基金项目(81472635和81672795),国家自然科学基金项目(ZD2015004)

    分类号: Q75

    DOI: 10.27009/d.cnki.gdblu.2019.000454

    总页数: 61

    文件大小: 4521K

    下载量: 51

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