应用CRISPR/Cas9构建稳定表达CPV结构蛋白VP2的HEK293T细胞系

论文摘要

为了构建犬细小病毒（canine parvovirus,CPV）结构蛋白VP2稳定表达的HEK293T细胞系,以2017年新分离的CPV-WH株为材料,扩增其VP2基因,并进行进化树分析。根据安全插入位点AAVS1位点序列设计sgRNA,并构建Cas9及sgRNA的表达载体PX335-U6-sgRNA-Cas9,同时构建含有VP2的特异性同源序列的片段HM-puro-eGFP-VP2-HA,将两者共转染HEK293T细胞后,通过嘌呤霉素筛选稳定表达VP2的HEK293T细胞株,并通过测序确定VP2正确插入。进化树分析显示CPV-WH的VP2存在S557N、T570K 2个氨基酸突变,该氨基酸位点可能与病毒免疫逃逸有关。通过荧光观察和免疫印迹确定了稳定表达细胞系中VP2的表达。本研究利用CRISPR/Cas9技术成功构建了表达CPV结构蛋白VP2的HEK293T细胞,为后期制备CPV样颗粒提供细胞模型。

论文目录

• 1 材料与方法
•   1.1 病毒、质粒、细胞及主要试剂
•   1.2 CPV的增殖
•   1.3 CPV全基因组的提取
•   1.4 HEK293T细胞基因组的提取
•   1.5 引物设计与合成
•   1.6 VP2表达载体pHM-puro-eGFP-VP2-HA的构建
•   1.7 sgRNA及Cas9核酸酶表达载体PX335-U6-sgRNA-Cas9的构建
•   1.8 嘌呤霉素工作质量浓度的确定
•   1.9 稳定表达CPV-WH-VP2的细胞系的筛选
•   1.10 稳定表达CPV-WH株VP2蛋白细胞系的Western blot检测
• 2 结果
•   2.1 CPV的增殖
•   2.2 VP2基因的PCR扩增
•   2.3 VP2基因测序及进化树分析
•   2.4 pX335-AAVS1-sgRNA质粒的构建
•   2.5 重组质粒pHM-puro-eGFP-VP2-HA的构建
•   2.6 稳定表达CPV-WH-VP2蛋白细胞系的建立与鉴定
• 3 讨论

文章来源

类型: 期刊论文

作者: 骆茹梦,刘媛,朱记平,李毅

关键词: 技术,稳定表达

来源: 中国兽医学报 2019年08期

年度: 2019

分类: 农业科技,基础科学

专业: 生物学,畜牧与动物医学

单位: 武汉生物工程学院生命科学与技术学院应用生物技术研究中心

基金: 国家自然科学基金资助项目(31470268),湖北省自然科学基金资助项目(2017CFB228)

分类号: S852.655

DOI: 10.16303/j.cnki.1005-4545.2019.08.10

页码: 1476-1483

总页数: 8

文件大小: 2603K

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