外泌体与新城疫病毒感染的双向调控机制

论文摘要

新城疫是由新城疫病毒（Newcastle disease virus,NDV）强毒株感染家禽引起的急性、高度接触性传染病,对养禽业造成巨大经济损失。寻求防控ND的新途径已成为亟待解决的重大科学与生产实际问题。NDV强毒株感染宿主后能造成特定黏膜组织或神经组织病理性损伤,而免疫系统却无法有效控制病毒的全身性扩散,甚至出现免疫功能紊乱,致使机体对病毒的消除效率降低,造成全身性感染并最终导致急性死亡。外泌体是一种介导细胞间通讯的纳米级囊泡,可通过其携带的蛋白质、核酸、脂类等物质调节摄取这些外泌体的细胞的生物学活性。近年来有多项研究表明,外泌体及其组分与病毒感染以及宿主抗病毒免疫反应有着密切的联系。有些病毒感染会改变外泌体的组成成分,并利用外泌体传递病毒特异性分子至相关免疫细胞并抑制其抗病毒反应,创造利于自身复制传播的微环境以逃避免疫系统。因此,研究外泌体在病毒感染过程中的作用对深入认识病毒的致病机理十分重要。然而,目前外泌体在新城疫病毒感染中的作用及其机制尚不明确。为丰富和诠释外泌体相关病病毒感染机理,本研究在对NDV感染细胞分泌的外泌体进行了分离与鉴定的基础上,分析了外泌体转录测序组学数据,检测了其中的病毒成分;通过对NDV感染促进外泌体分泌的作用模式的初步探讨,明确了病毒感染与外泌体释放的关联性,探讨了NDV感染促进外泌体分泌的信号通路;在此基础上,为了解析外泌体对病毒感染的促进机制,结合上述外泌体的组分数据,分析了外泌体携带病毒组分及宿主因子对病毒复制与增殖的影响,揭示外泌体介导新城疫病毒感染的作用机制,为丰富外泌体相关的病毒感染机理以及NDV感染机制的理解与新城疫防控策略提供新的理论基础。本研究采用PEG沉淀结合CD81磁珠免疫亲和法提取了无病毒粒子污染的外泌体（NDV Ex）。经分析发现NDV Ex中不包含NDV基因组,但是包含部分病毒蛋白（NP、F、W、V）。在此基础上,本研究分析了NDV感染后禽胚胎成纤维细胞（chicken embryo fibroblast,CEF）来源的外泌体转录组变化,发现多数抗病毒感染相关基因m RNA在NDV感染后在外泌体中显著下调,然而依然存在NDV感染后在外泌体中表达上调的抗病毒相关基因m RNA。为了研究这些差异表达的基因在NDV感染中的作用,本研究筛选并在HD11、DF-1、Hela细胞中验证了7个NDV感染后显著上调的抗病毒相关基因。由于目前缺少禽源细胞外泌体定量方法,本研究筛选并验证了2个NDV感染后表达水平无显著差异m RNA,并以此建立了一种检测外泌体的相对定量的荧光定量方法。借助该荧光定量检测方法,本研究进一步明确了NDV感染与外泌体释放的关联。结果发现,强弱毒株的NDV感染都可以促进多种细胞外泌体的释放。不同的病毒组分模拟物也可以促进外泌体释放,但促进程度不及活病毒感染。另外,细胞上清中外泌体的总体含量趋向于稳定,并不会随时间的推进持续上升,说明了外泌体的释放与摄入的动态平衡。然而NDV如何促进外泌体分泌目前尚无定论。目前有两种公认的外泌体分泌途径,即ESCRT依赖性和ESCRT非依赖性途径。通过分析NDV感染后几种外泌体分泌相关的基因的m RNA表达量,我们发现,几种相关基因中,仅ESCRT途径中的ALIX显著上升,TSG101无变化,其他几种基因表达量都显著下降。si RNA介导的ALIX沉默可以逆转NDV促进的ALIX表达上升。与此同时,ALIX/TSG101沉默同样可以逆转NDV感染导致的外泌体分泌量上升以及NDV相关m RNA在外泌体中含量的上升,说明了ESCRT信号通路在NDV感染通过刺激外泌体的生成与释放的作用。在已知NDV感染促进外泌体分泌的基础上,我们对外泌体对病毒复制的作用进行了初步探讨。外泌体感染实验证实了NDV Ex不具有感染性,但外泌体添加及外泌体抑制剂（GW4869）处理实验说明了NDV Ex可以促进NDV复制。进一步,我们检测NDV Ex携带的NDV结构蛋白NP在NDV复制中的作用,显示NP蛋白可以通过外泌体转移至DF-1细胞。细胞内的NP蛋白表现出促进病毒复制作用以及对抗病毒细胞因子分泌的抑制能力。以上结果表明NDV感染产生的外泌体可以通过转移病毒NP蛋白,抑制抗病毒相关细胞因子的分泌,进而促进NDV感染。尽管转录组学分析表明多数基因在NDV感染后表达量在外泌体中显著下降,但仍有多种抗病毒相关基因的表达量显著上升,这些抗病毒相关因子的分泌可能与外泌体NP蛋白介导的促病毒作用发生拮抗。为了明确这些外泌体携带基因在NDV感染中的作用,我们检测了几种抗病毒相关基因m RNA的细胞内表达水平,发现NLRX1在NDV感染前后的变化更为显著,且NDV强毒株感染不但促进NLRX1 m RNA在细胞外泌体中的含量,还会降低细胞内NLRX1蛋白及m RNA水平的表达,而外泌体抑制剂GW4869处理可以在降低外泌体NLRX1 m RNA的同时提升细胞内NLRX1含量,说明NDV感染可以通过外泌体向外排出NLRX1 m RNA降低其在细胞内的含量,以促进病毒的复制增殖。进一步研究表明,外泌体中既不含有NLRX1蛋白,经外泌体排出的NLRX1 m RNA也不会在受体细胞中转录为NLRX1蛋白,因而不会抵消NLRX1 m RNA排出造成的促病毒增殖效应。综上所述,本研究鉴定了新城疫病毒感染来源的外泌体,明确了NDV感染促进外泌体释放的作用模式,首次揭示了外泌体通过携带病毒NP蛋白以及宿主NLRX1 m RNA促进病毒感染与复制的作用机制,丰富了NDV感染的致病机制,为新城疫防治策略提供新的理论基础。

论文目录

• 中文摘要
• abstract
• 引言
• 第一篇 文献综述
•   第1章 外泌体研究进展
•     1.1 外泌体的组成
•     1.2 外泌体与病毒感染
•     1.3 外泌体生成机制
•     1.4 外泌体的释放
•     1.5 外泌体靶向受体细胞的调节作用
•   第二章 新城疫病毒的致病机制
• 第二篇 研究内容
•   第一章 NDV Ex的分离和转录组学分析
•     1.1 材料与方法
•     1.2 结果
•     1.3 讨论
•     1.4 小结
•   第二章 NDV感染对外泌体释放的影响
•     2.1 材料与方法
•     2.2 结果
•     2.3 讨论
•     2.4 小结
•   第三章 外泌体对NDV在细胞中增殖的影响
•     3.1 材料与方法
•     3.2 结果
•     3.3 讨论
•     3.4 小结
•   第四章 NDV Ex促病毒增殖的机制研究
•     4.1 材料与方法
•     4.2 结果
•     4.3 讨论
•     4.4 小结
• 结论
• 参考文献
• 导师简介
• 作者简介
• 学位期间取得的科研成果
• 致谢

文章来源

类型: 博士论文

作者: 徐小洪

导师: 丁壮

关键词: 新城疫病毒,外泌体,调控

来源: 吉林大学

年度: 2019

分类: 基础科学,农业科技

专业: 生物学,畜牧与动物医学

单位: 吉林大学

基金: 国家自然基金面上项目“外泌体在新城疫病毒感染及宿主天然免疫应答中的调控机制研究”(31772735)

分类号: S852.65

总页数: 134

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