短链非编码RNA的输运及功能

论文摘要

短链非编码RNA（Small non-coding RNA）是一类长度不超过40 nt且不参与蛋白质编码的RNA。短链非编码RNA分子虽小,却参与了包括细胞增殖、分化、凋亡、细胞代谢以及机体免疫在内的几乎所有生命活动的调节和控制,在生命体内扮演着至关重要的角色。一些短链非编码RNA,如微小核糖核酸（microRNA,miRNA）以及小干扰RNA（siRNA）,可对细胞内靶基因进行调控,其中某些可抑制体内一些致病基因如致癌基因表达的miRNA或siRNA被认为在针对癌症等疾病的临床治疗中具有潜在的应用价值。本论文工作主要针对这两类短链非编码RNA,开发针对miRNA或siRNA的细胞内输运及细胞内功能的实时监测等的新方法。然而,由于miRNA类似物、miRNA抑制剂与siRNA本身带有负电性,因此无法直接通过细胞膜进入细胞发挥功能,且较容易被生物体内广泛存在的核酸酶所降解。因此,开发将非编码RNA输运进入细胞的有效方法,实现将其高效运输到细胞内的同时保护其不被核酸酶等降解,这对于发展基于非编码RNA的疾病治疗方案具有重要的意义。另一方面,在输运短链非编码RNA进入细胞内的同时,若能有探针对其在细胞内发挥功能的情况进行实时监测,则对于载体的进一步优化可提供重要的指导。在这一背景下,本文主要开发向细胞内输运miRNA类似物及siRNA的新方法及输运载体-功能监测一体化探针,具体包括:1.基于阳离子穿膜肽的miRNA靶向输运方法基于阳离子多肽可与miRNA或siRNA通过静电相互作用自组装形成纳米复合物的特点,我们对阳离子穿膜肽九聚精氨酸（R9）进行结构修饰,将对不同肿瘤具有靶向性的环状RGD或叶酸修饰在R9末端,使其分别与miRNA通过静电作用自组装形成纳米复合物。我们通过实验证实了该两种阳离子穿膜肽不仅可以高效运输miRNA到对应的靶细胞中,而且可以实现在混合细胞体系中将miRNA运送到特定的癌细胞中,具有很好的靶向性。该方法为在多细胞环境下实现miRNA的细胞选择性输送提供了新思路。2.针对miRNA递送/功能监测的一体化多功能探针基于生物正交官能团对R9的修饰,结合铜催化的点击反应及紫外光诱导的光点击反应这两类生物相容反应,我们开发了构建多功能多肽复合探针的“模块组装”新方法,并借助这一方法构建了集向细胞内递送miRNA及对递送进入细胞内的miRNA功能进行实时监测两种功能为一体的多功能探针。该探针可与miRNA通过静电作用自组装形成纳米复合物,多功能复合探针中的靶向基团可以将纳米复合物输运进入特定的癌细胞,在输运进入细胞的miRNA发挥功能并将其靶基因下游调控的凋亡相关蛋白酶caspase-3激活后,复合探针中的成像功能模块可通过荧光激活对于caspase-3被激活的情况进行实时监测。3.基于碳量子点载体的还原响应型miRNA输运方法基于对碳量子点的表面修饰,我们构建了对于还原性物种响应的miRNA输运-释放体系。miRNA通过二硫键修饰到碳点表面,在癌细胞的还原性微环境中二硫键发生断键,从而实现miRNA在癌细胞内的可控释放。这一策略是对于基于自组装纳米复合物输运体系的一个补充。4.基于抗体的光调控型siRNA输运体系针对可抑制细胞内细胞程式死亡配体1（Programmed death ligand 1,PD-L1）表达的siRNA,我们设计和构建了一种光控释放型抗体-siRNA偶联物,用于siRNA向PD-L1高表达的肿瘤细胞的输运。PD-L1的siRNA与PD-L1的抗体之间通过紫外光响应连接子共价连接,在结合PD-L1高表达的肿瘤细胞并内吞进入细胞后,通过温和的紫外光照将抗体-siRNA偶联物上的siRNA释放,使其发挥抑制胞内PD-L1表达的功能。对于该体系的初步试验已经展示出同时阻断细胞膜PD-L1和消除细胞内持续生成的PD-L1的可行性。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 第一章 绪论
•   1.1 miRNA
•     1.1.1 miRNA的产生及生物学功能
•     1.1.2 miRNA的病理意义
•     1.1.3 miRNA的调控
•   1.2 siRNA
•     1.2.1 siRNA的结构与生物学功能
•     1.2.2 siRNA与疾病治疗
•   1.3 短链非编码RNA的运输
•     1.3.1 基于病毒类载体的短链非编码RNA运输
•     1.3.2 基于脂质体的短链非编码RNA运输
•     1.3.3 基于有机高分子载体的短链非编码RNA运输
•     1.3.4 基于纳米材料的短链非编码RNA运输
•   1.4 阳离子穿膜肽在核酸运输中的应用
•   1.5 抗体在核酸运输中的应用
•   1.6 短链非编码RNA的临床应用
•     1.6.1 miRNA的临床应用
•     1.6.2 siRNA的临床应用
•   1.7 立题依据
• 第二章 基于阳离子多肽的自组装型miRNA靶向输运系统
•   2.1 引言
•   2.2 实验结果与讨论
•     2.2.1 靶向性阳离子多肽的设计与合成
•     2.2.2 miRNA与两种阳离子多肽自组装反应的表征
•     2.2.3 自组装形成的复合物向细胞内输运miRNA的效率表征
•     2.2.4 自组装形成的纳米复合物的靶向能力评价
•     2.2.5 利用自组装形成的纳米复合物输运miRNA进细胞过程的研究
•     2.2.6 输运进细胞的miRNA功能评价
•     2.2.7 混合细胞中利用该体系实现不同miRNA运输到不同细胞中的研究
•   2.3 本章小结
•   2.4 实验部分
• 第三章 新型miRNA输送/功能监测一体化多肽探针的构建
•   3.1 引言
•   3.2 实验结果与讨论
• cas3的构建'>    3.2.1 多功能多肽FA-R9-FP_cas3的构建
• cas3自组装的表征'>    3.2.2 miRNA与多功能多肽FA-R9-FP_cas3自组装的表征
•     3.2.3 自组装形成的纳米复合物的细胞水平靶向能力评价
•     3.2.4 自组装形成的纳米复合物靶向运输miRNA的机制研究
•     3.2.5 自组装形成的纳米复合物在活体中对miRNA的靶向运输能力评价
•     3.2.6 自组装形成的纳米复合物靶向运输miR-34a的同时实现对细胞内的Caspase-3的激活情况进行实时成像的研究
•     3.2.7 自组装形成的纳米复合物的治疗效果评价
•   3.3 本章小结
•   3.4 实验部分
• 第四章 基于碳点的还原响应型miRNA输运方法
•   4.1 引言
•   4.2 实验结果与讨论
•     4.2.1 氨基修饰碳点的合成与表征
•     4.2.2 炔键修饰在3'末端的miRNA的合成与生物活性评估
•     4.2.3 基于碳点的还原响应型miRNA输运系统的构建与表征
•     4.2.4 负载miRNA的碳点体外控制释放表征
•     4.2.5 负载miRNA的碳点向细胞内输运miRNA效率的表征
•     4.2.6 输运进细胞的miRNA功能评价
•   4.3 本章小结
•   4.4 实验部分
• 第五章 基于抗体靶向的光调控型siRNA输运体系的构建
•   5.1 引言
•   5.2 实验结果与讨论
•     5.2.1 抗体-siRNA偶联物的构建与表征
•     5.2.2 抗体-siRNA偶联物光照下释放siRNA能力评价
•     5.2.3 抗体-siRNA偶联物细胞水平靶向能力评价及靶向运输siRNA的机制研究
•     5.2.4 抗体-siRNA偶联物对肿瘤细胞PD-L1表达量的影响评价
•     5.2.5 抗体-siRNA偶联物对免疫治疗效果影响评价
•   5.3 本章小结
•   5.4 实验部分
• 全文总结
• 博士期间己发表论文、专利
• 致谢
• 参考文献

文章来源

类型: 博士论文

作者: 肖潇

导师: 张艳

关键词: 短链非编码,可控释放,靶向运输,功能成像,肿瘤治疗

来源: 南京大学

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学

单位: 南京大学

分类号: Q522

DOI: 10.27235/d.cnki.gnjiu.2019.000060

总页数: 156

文件大小: 12752K

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