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H5和H7亚型禽流感ELISA抗体检测方法的建立

2020-12-10阅读(296)

H5和H7亚型禽流感ELISA抗体检测方法的建立

论文摘要

高致病性禽流感（highly pathogenic avian influenza,HPAI）是由一些H5和H7亚型禽流感病毒引起的高致病性和高死亡率的烈性禽类传染病,对养禽业造成严重的危害,并具有重要的公共卫生学意义。DNA疫苗是可以有效防控禽流感的基因工程疫苗之一,已经获批一类新兽药证书,现地应用需要相应配套的、更敏感的评价和检测方法。因此,本研究拟建立一种比HI方法更为敏感的ELISA方法,为基因工程疫苗的推广应用提供必要的技术支撑。采用杆状病毒表达系统来表达当前主要流行毒株A/Chicken/Guizhou/4/2013（CK/GZ/4/13（H5N1））、A/Duck/Guizhou/S4184/2017（H5N6）（DK/GZ/S4184/2017（H5N6））和A/Chicken/Guangxi/SD098/2017（H7N9）（CK/GX/SD098/17（H7N9））的真核表达HA蛋白。分别以CK/GZ/4/13（H5N1）、CK/GX/SD098/2017（H7N9）和DK/GZ/S4184/2017（H5N6）的HA基因为模板,将目的片段通过PCR扩增克隆至昆虫表达载体pFastBac1中构建重组质粒pFastBac1-HA;再将其转座至DH10Bac感受态细胞,利用蓝白斑筛选得到重组杆粒rBacmid-HA;利用脂质体转染的方法将重组杆粒转染SF9细胞并获得重组杆状病毒;采用间接免疫荧光试验（IFA）、western blot对所表达的蛋白进行表达鉴定;并利用Hi5细胞大量表达HA蛋白并对其进行纯化。结果表明H5HA和H7HA蛋白具有良好的抗原性,可初步作为检测方法的良好抗原。H5和H7亚型间接ELISA检测方法的建立。首先采用棋盘滴定法确定抗原和血清的最佳结合浓度,再通过控制变量的方法来依次确定封闭液的选择及作用时间、一抗稀释液的选择及作用时间、酶标二抗的最佳稀释浓度及作用时间,最后进行临界值的确定、重复性、特异性及灵敏性试验的检测并进行临床样品检测,从而建立间接ELISA抗体检测方法。其中H5亚型最佳工作条件为:用包被浓度为2 ng/μL的蛋白包被ELISA板,采用1%BSA封闭液封闭2 h,一抗血清使用商品化一抗稀释液按照1:50倍稀释并孵育1.5 h,酶标二抗则按照1:2000倍稀释孵育1h,建立的H5亚型ELISA方法具有良好的灵敏性和特异性,和HI的相关性方程为y=9.616*x-1.888,R2=0.8246,相关性良好;至于H7亚型间接ELISA方法的工作条件,除了包被蛋白的浓度为5 ng/μL外,其余均与H5亚型相同。建立的H7亚型的间接ELISA方法灵敏性较好,但和其他亚型存在交叉反应,和HI相关性方程为y=9.139*x+0.3650,R2=0.7873,存在较好的相关性。间接ELISA抗体检测方法的建立为下一步试剂盒的研制打下了良好的基础。

论文目录

  • 摘要
  • abstract
  • 第一章 引言
  •   1.1 流感病毒的概述
  •   1.2 高致病性禽流感的危害
  •     1.2.1 H5亚型HPAIV的危害
  •     1.2.2 H7N9亚型HPAI的危害
  •   1.3 禽流感基因工程疫苗的研究进展
  •     1.3.1 DNA疫苗的研究进展
  •     1.3.2 禽流感基因重组活载体疫苗的研究进展
  •     1.3.3 禽流感基因工程亚单位疫苗的研究进展
  •   1.4 杆状病毒表达系统的研究进展
  •   1.5 抗体检测方法的研究进展
  •     1.5.1 HI方法的概述
  •     1.5.2 NI方法的概述
  •     1.5.3 AGP方法的概述
  •     1.5.4 ELISA方法的研究进展
  •     1.5.5 全自动免疫发光法的进展
  •   1.6 本研究的目的和意义
  • 第二章 Clade2.3.4.4 H5亚型禽流感病毒HA蛋白的杆状病毒系统表达
  •   2.1 材料与方法
  •     2.1.1 主要实验材料
  •     2.1.2 重组质粒pFastBac1-GZ4、pFastBac1-S4184 的构建及鉴定
  •     2.1.3 rBacmid-GZ4、rBacmid-S4184 重组杆粒的构建及鉴定
  •     2.1.4 重组病毒rBV-GZ4、rBV-S4184 的获得及蛋白表达
  •     2.1.5 蛋白的大量制备及纯化
  •   2.2 结果
  •     2.2.1 重组质粒pFastBac1-GZ4、pFastBac1-S4184 的构建和鉴定
  •     2.2.2 重组杆粒reBacmid-GZ4、重组杆粒reBacmid-SD098的PCR鉴定
  •     2.2.3 杆状病毒上清DNA的 PCR鉴定
  •     2.2.4 间接免疫荧光（IFA）鉴定HA蛋白的表达
  •     2.2.5 western blot鉴定HA蛋白的表达
  •     2.2.6 蛋白的大量表达及纯化
  •   2.3 讨论
  • 第三章 H7亚型禽流感病毒HA蛋白的杆状病毒系统表达
  •   3.1 材料与方法
  •     3.1.1 主要实验材料
  •     3.1.2 重组质粒pFastBac1-SD098的构建
  •     3.1.3 rBacmid-SD098 重组杆粒的构建及鉴定
  •     3.1.4 rBV-SD098 重组病毒的获得及蛋白表达
  •     3.1.5 蛋白的大量制备及纯化
  •   3.2 结果
  •     3.2.1 重组质粒pFastBac1-SD098的构建和鉴定
  •     3.2.2 重组杆粒reBacmid-SD098的鉴定
  •     3.2.3 杆状病毒上清DNA的 PCR鉴定
  •     3.2.4 间接免疫荧光（IFA）鉴定目的蛋白的表达
  •     3.2.5 western blot鉴定目的蛋白的表达
  •     3.2.6 蛋白的大量制备及纯化
  •   3.3 讨论
  • 第四章 H5亚型禽流感间接ELISA抗体检测方法的建立
  •   4.1 材料与方法
  •     4.1.1 试验用血清
  •     4.1.2 试验用试剂
  •     4.1.3 试验用仪器及耗材
  •     4.1.4 间接ELISA方法操作程序
  •     4.1.5 间接ELISA方法工作条件的确定
  •   4.2 实验结果
  •     4.2.1 GZ4蛋白与血清的间接ELISA方法工作条件的优化
  •   4.3 讨论
  • 第五章 H7亚型禽流感间接ELISA抗体检测方法的建立
  •   5.1 材料与方法
  •     5.1.1 试验用血清
  •     5.1.2 试验试剂
  •     5.1.3 试验用仪器及耗材
  •     5.1.4 实验方法
  •   5.2 实验结果
  •     5.2.1 SD098蛋白与血清的间接ELISA方法的工作浓度的确定
  •   5.3 讨论
  • 第六章 全文结论
  • 参考文献
  • 致谢
  • 作者简历

    • 文章来源

    类型: 硕士论文

    作者: 梁真洁

    导师: 姜永萍

    关键词: 高致病性禽流感,杆状病毒表达系统,蛋白,间接

    来源: 中国农业科学院

    年度: 2019

    分类: 基础科学,农业科技

    专业: 生物学,畜牧与动物医学

    单位: 中国农业科学院

    分类号: S852.65

    总页数: 54

    文件大小: 2182K

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