黄瓜AGL15-like基因的克隆及功能分析

论文摘要

MADS-box是一个转录因子基因家族,在植物生长发育过程中起着非常重要的作用。AGAMOUS-like15（AGL15-like）是MADS-box基因家族中的一个亚家族,在植物体细胞胚胎发生、花器官转变、叶片和果实发育等过程中的作用尤为明显;然而AGL15-like基因在黄瓜（Cucumis sativus L.）中的研究未见报道,克隆黄瓜AGL15-like基因并对其进行功能研究,有助于阐明黄瓜花器官发育的分子机理。本研究从黄瓜中克隆了拟南芥AtAGL15和AtAGL18的直系同源基因CsMADS25和CsMADS26,并对它们进行了生物信息学和表达特性分析。此外,通过构建CsMADS25和CsMADS26基因的过表达载体并遗传转化拟南芥,通过分析转基因拟南芥的形态学观察来对这两个基因的功能进行研究,主要的结果如下:（1）CsMADS25基因的开放阅读框（ORF）长度为810 bp,编码269个氨基酸。CsMADS26基因的开放阅读框长度为669 bp,编码222个氨基酸。CsMADS25和CsMADS26均属亲水的酸性蛋白,含MADS-box转录因子的MADS和K功能域以及多个DNA结合位点。系统进化树分析表明,CsMADS25属于AGL15亚家族中的AGL18分支,CsMADS26被划分为AGL15分支。（2）qRT-PCR表达分析表明:CsMADS25主要在根和叶中表达,CsMADS26主要在雄花和雌花中表达。逆境胁迫响应分析表明:在相同的冷、盐（NaCl）、干旱（PEG）以及ABA条件处理下,CsMADS26基因的胁迫响应明显高于CsMADS25基因,且它们俩的表达模式明显不同。（3）CsMADS25和CsMADS26基因遗传转化到拟南芥中,结果发现:过表达CsMADS25基因的拟南芥植株出现矮小和小叶的表型,过表达CsMADS26基因的转基因拟南芥植株呈现卷曲的玫瑰花结和茎生叶,并且转基因拟南芥叶片大小都明显小于野生型（WT）植株,而转基因植株的叶形指数（叶长/宽比）却明显高于野生型植株。这些结果揭示了CsMADS25和CsMADS26基因在调控黄瓜叶片发育中具有重要作用,为今后的功能解析提供了线索。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 文献综述
•   1.1 花发育研究进展
•     1.1.1 花发育过程
•     1.1.2 花器官发育的ABCDE模型
•     1.1.3 黄瓜花发育研究进展
•   1.2 MADS-box的研究和进展
•     1.2.1 MADS-box基因的分类
•     1.2.2 MADS-box基因的结构特性
•     1.2.3 MADS-box基因对植物发育的调控
•     1.2.4 MADS-box基因的抗逆功能
•   1.3 AGL15-like基因的研究和进展
•     1.3.1 AGL15-like基因的发现
•     1.3.2 AGL15-like基因对花器官的调控
•     1.3.3 AGL15-like基因对体细胞胚的调控
•     1.3.4 AGL15-like基因的抗逆功能
•   1.4 研究目的与意义
• 第二章 黄瓜AGL15-like基因的生物信息学分析
•   2.1 实验方法
•     2.1.1 黄瓜AGL15-like基因的信息数据来源
•     2.1.2 CsMADS25和CsMADS26 基因的结构分析
•     2.1.3 AGL15-like基因多序列比对及系统进化树的构建
•     2.1.4 CsMADS25和CsMADS26 基因的启动子顺式元件分析
•     2.1.5 CsMADS25和CsMADS26 基因的其它生物信息学分析
•   2.2 结果与分析
•     2.2.1 CsMADS25和CsMADS26 基因的染色体定位及基本参数分析
•     2.2.2 CsMADS25和CsMADS26 基因的内含子分析
•     2.2.3 CsMADS25和CsMADS26 蛋白序列分析
•     2.2.4 CsMADS25和CsMADS26 基因的多序列比对及系统进化树的构建
•     2.2.5 CsMADS25和CsMADS26 基因的启动子顺式元件分析
•     2.2.6 CsMADS25和CsMADS26 蛋白的跨膜结构与亲疏水性分析
•     2.2.7 CsMADS25和CsMADS26 蛋白的结构域与亚细胞定位分析
•     2.2.8 CsMADS25和CsMADS26 蛋白的二级结构与三级结构预测
•   2.3 讨论与小结
• 第三章 黄瓜AGL15-like基因的表达分析
•   3.1 实验材料
•     3.1.1 植物材料
•     3.1.2 试剂和仪器
•     3.1.3 引物
•   3.2 实验方法
•     3.2.1 植物材料培养及处理
•     3.2.2 RNA的提取和c DNA的合成
•     3.2.3 CsMADS25和CsMADS26 基因的组织表达谱分析
•     3.2.4 CsMADS25和CsMADS26 基因在不同胁迫条件下的胁迫反应
•     3.2.5 统计分析
•   3.3 结果与分析
•     3.3.1 CsMADS25和CsMADS26 基因的组织表达谱分析
•     3.3.2 CsMADS25和CsMADS26 基因在不同胁迫条件下的胁迫反应
•   3.4 讨论与小结
• 第四章 黄瓜AGL15-like基因的克隆及拟南芥遗传转化
•   4.1 实验材料
•     4.1.1 植物材料
•     4.1.2 菌种与载体
•     4.1.3 酶和试剂
•     4.1.4 引物
•   4.2 实验方法
•     4.2.1 CsMADS25和CsMADS26 基因的克隆
•       4.2.1.1 RNA的提取和c DNA的合成
•       4.2.1.2 黄瓜CsMADS25和CsMADS26 基因的PCR扩增
•       4.2.1.3 目的基因的胶回收
•       4.2.1.4 目的基因与T载体的连接
•       4.2.1.5 大肠杆菌热激转化
•       4.2.1.6 重组子菌液鉴定与测序
•     4.2.2 过表达载体的构建及转化
•       4.2.2.1 pMD18 重组质粒的提取
•       4.2.2.2 pMD18 重组质粒和植物表达载体PHB的双酶切
•       4.2.2.3 目的基因和植物表达载体PHB的连接
•       4.2.2.4 PHB重组质粒转化大肠杆菌DH5α感受态细胞
•       4.2.2.5 PHB基因重组质粒的菌液PCR、酶切鉴定和测序
•       4.2.2.6 农杆菌GV3101 感受态细胞的电击转化
•       4.2.2.7 菌落PCR筛选阳性转化菌落
•     4.2.3 农杆菌介导的拟南芥遗传转化
•       4.2.3.1 拟南芥的种植
•       4.2.3.2 侵染拟南芥
•       4.2.3.3 阳性植株的筛选
•       4.2.3.4 CsMADS25和CsMADS26 在转基因拟南芥植株的表达
•       4.2.3.5 转基因拟南芥的形态学观察
•   4.3 结果与分析
•     4.3.1 黄瓜AGL15-like基因CsMADS25和CsMADS26 的克隆
•       4.3.1.1 总RNA的提取
•       4.3.1.2 目的基因的PCR扩增
•       4.3.1.3 目的基因的胶回收
•       4.3.1.4 目的基因与T载体的连接以及大肠杆菌的转化
•       4.3.1.5 重组子的菌液鉴定与测序
•     4.3.2 过表达载体的构建及转化
•       4.3.2.1 pMD18 基因重组质粒的提取以及酶切
•       4.3.2.2 PHB重组质粒菌液PCR以及酶切鉴定
•       4.3.2.3 农杆菌的转化
•     4.3.3 农杆菌介导的拟南芥遗传转化
•       4.3.3.1 拟南芥的遗传转化与筛选
•       4.3.3.2 CsMADS25 以及CsMADS26 基因在转基因拟南芥中的表达
•       4.3.3.3 转基因拟南芥的形态学观察
•   4.4 讨论与小结
• 第五章 全文讨论与结论
•   5.1 全文讨论
•     5.1.1 CsMADS25和CsMADS26 基因的表达特征分析
•     5.1.2 CsMADS25和CsMADS26 基因的功能分析
•   5.2 结论
• 参考文献
• 致谢
• 附录
• 个人简历

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 戈伶俐

导师: 杨寅桂,刘世强

关键词: 黄瓜,基因克隆,遗传转化

来源: 江西农业大学

年度: 2019

分类: 基础科学,农业科技

专业: 生物学,生物学,园艺

单位: 江西农业大学

分类号: S642.2;Q943.2

DOI: 10.27177/d.cnki.gjxnu.2019.000172

总页数: 76

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