RKHog1基因敲除对红冬孢酵母YM25235低温生长适应性的影响

论文摘要

由Hog1介导的高渗透压甘油促有丝分裂原活化蛋白激酶（High osmolarity glycerol mitogen-activated protein kinase,HOG-MAPK）信号途径是真核生物中高度保守的胞内信号转导途径,它在细胞的抗逆响应,尤其是在对高渗透压、氧化压力、有机酸、低pH、热休克和低温等的耐受上都扮演了极为重要的角色,但目前未见HOG-MAPK信号转导途径与真菌多不饱和脂肪酸（polyunsaturated fatty acid;PUFA）低温合成有关的报道。我们前期的研究发现,在产油酵母—红冬孢酵母（Rhodosporidium kratochvilovae）YM25235菌株中过表达RKHog1基因可明显促进YM25235菌株对高盐和高渗透压胁迫的适应性,还能促进YM25235菌株低温生长适应性和低温条件下亚油酸（linoleic acid,LA）和α-亚麻酸（α-linoleinic acid,ALA）两种PUFA的合成增加,表明RKHog1基因与YM25235菌株的低温生长适应性和低温条件下菌株中PUFA的合成可能有关。为了进一步阐明这种关系,本研究拟用同源重组方法对YM2535菌株中RKHog1基因进行敲除,进一步对RKHog1基因的功能进行验证,揭示YM25235菌株低温生长适应性和低温条件下PUFA低温合成增加的信号转导途径与RKHog1的关系。首先通过同源重组的方法将YM2535菌株中RKHog1基因进行敲除。根据YM25235菌株RKHog1基因组序列及其上下游侧翼序列克隆得到大小为1480 bp、1820 bp的A和B两个片段,分别插入到质粒pRH2034上潮霉素B（hygromycin B）表达框两侧,构建了RKHog1基因敲除片段,进一步通过电击转化法将其转化至YM25235菌株中进行同源重组。经抗性筛选获得了672个转化子,经过胁迫抗性筛选和基因组DNA的PCR验证成功获得了3株RKHog1基因敲除株YM25235RKHog1Δ。胁迫抗性分析结果显示,RKHog1基因敲除导致YM25235菌株中甘油合成减少,降低菌株对盐胁迫以及渗透压胁迫的耐受性以及低温生长适应性。而且,低温条件下RKHog1基因敲除显著降低了YM25235菌株中催化亚油酸（Linoleic acid;LA）和α-亚麻酸（α-Linolenic acid;ALA）合成的关键酶—Δ12/15-脂肪酸脱氢酶(Δ12/15-desaturase)基因RKD12的转录水平,导致LA和ALA两种PUFA的合成水平也显著下降,分别从对照菌株的27.76%和7.97%降到23.15%和6.02%,分别下降了16.6%和24.5%。这些结果都与RKHog1基因过表达YM25235菌株的分析结果相反,表明低温条件下RKHog1蛋白调节YM25235菌株中PUFA的合成增加,进而促进YM25235菌株的低温生长适应性。同时,与类似文献报道一致,RKHog1基因与YM25235菌株的细胞壁及细胞膜压力应答有关,且与细胞周期蛋白的调节有关。进一步构建G418抗性的RKHog1基因表达的重组质粒pRGRKHog1,将其转化回基因敲除突变株YM25235RKHog1Δ中进行表达,成功获得RKHog1基因回补菌株YM25235RKHog1Δ/pRGRKHog1。环境胁迫抗性分析结果表明,RKHog1基因回补使RKHog1基因敲除突变菌株YM25235RKHog1Δ恢复了甘油合成水平以及对盐胁迫、渗透压胁迫和低温生长的适应性,而且低温条件下RKD12基因的转录水平以及LA和ALA两种PUFA的合成水平也恢复到正常水平,分别为28.79%和8.59%。这些结果进一步证明,除了与YM25235菌株的盐胁迫和渗透压胁迫适应有关外,RKHog1基因还与低温条件下YM25235菌株中PUFA合成增加有关,从而促进YM25235菌株的低温生长适应性。此外,细胞壁及细胞膜压力表型分析也再次表明,RKHog1基因还与YM25235菌株的细胞膜和细胞壁压力应答有关,且与细胞周期蛋白的调节有关。很多研究表明,Hog1活性调节与蛋白的磷酸化水平有关。对上述不同菌株15℃培养条件下RKHog1蛋白磷酸化水平分析结果显示,低温条件下RKHog1基因过表达菌株YM25235/pRHRKHog1的RKHog1蛋白磷酸化程度最高,RKHog1基因敲除突变株YM25235RKHog1Δ未检测到RKHog1蛋白磷酸化水平,而基因回补的RKHog1基因敲除突变菌株中恢复了与对照菌株类似的RKHog1蛋白磷酸化水平,这与菌株的功能分析结果一致,表明低温促进了RKHog1蛋白磷酸化水平,提高了低温条件下PUFA合成水平和YM25235菌株低温生长适应性。此外,我们前期的研究已经表明组氨酸激酶HisK2301和锌指转录因子RKMsn4也可能与YM25235菌株低温条件下中PUFA合成增加和菌株的低温生长适应性有关,而本研究结果显示RKHog1基因敲除导致HisK2301基因和RKMsn4基因的mRNA转录水平也显著下降,表明RKHog1和HisK2301、RKMsn4一样,也与YM25235菌株感应低温信号并向内传递引起PUFA合成增加的信号转导途径有关,而且酵母双杂交分析结果表明RKHog1蛋白与锌指转录因子RKMsn4之间存在相互作用,但是RKHog1和HisK2301之间具体的相互关系还有待于进一步研究。很多研究也表明类胡萝卜素与微生物环境胁迫适应性有关,而YM2535菌株能合成圆红酵母素、酵母素和β-胡萝卜素等类胡萝卜素。因此,本研究还分析了RKHog1基因敲除对红冬孢酵母YM25235类胡萝卜素合成的影响。结果显示30℃和15℃培养条件下,YM25235RKHog1Δ菌株中类胡萝卜素含量均低于对照菌株中的类胡萝卜素含量,但在15℃培养条件下降更加明显,达33%,表明RKHog1基因也可能与低温条件下YM25235菌株中类胡萝卜素合成有关。进一步对YM25235菌株中4个类胡萝卜素合成相关基因3-羟基-3-甲基戊二酸甲酰CoA还原酶（3-hydroxy-3-methyl glutaric acid formyl CoA reductase）基因RKHCR,3-羟基-3-甲基戊二酸甲酰CoA合成酶（3-hydroxy-3-methyl glutaric acid formyl CoA synthetase）基因RKHCS,八氢番茄红素脱氢酶（Phytoene dehydrogenase）基因RKPdH和八氢番茄红素合成酶/番茄红素环化酶（Lycopene cyclase）基因RKLC的mRNA转录水平进行分析。结果显示,YM25235RKHog1Δ菌株中RKHog1基因敲除导致RKHCS基因的mRNA转录水平发生显著下调,这与其在对照菌株低温条件下mRNA转录水平提高相反,表明RKHog1蛋白与YM25235菌株中类胡萝卜素的低温合成调节有关,而且RKHCS基因在此过程中也具有重要的作用。总之,本研究通过基因敲除及基因回补方法最终证明RKHog1基因与红冬孢酵母YM25235菌株的盐和渗透压胁迫耐受性有关,而且还与YM25235菌株低温条件下PUFA合成调节和菌株的低温生长适应性有关,而且这些相关性与之前揭示的YM25235菌株中HisK2301基因和RKMsn4基因也有关。RKHog1基因敲除显著下调HisK2301和RKMsn4基因的mRNA转录水平,而且RKHog1与RKMsn4存在相互作用,但仍不清楚HisK2301和RKHog1蛋白之间具体的相互关系如何。此外,低温条件下RKHog1还可能调节RKHCS基因的转录水平,影响类胡萝卜素的合成水平。本研究有助于阐明红冬孢酵母YM25235菌株低温生长适应性与RKHog1介导的PUFA低温合成的信号转导途径以及RKHog1基因与YM25235菌株类胡萝卜素低温合成之间的关系,为进一步揭示低温条件下PUFA和类胡萝卜素合成的调节机制以及利用红冬孢酵母YM25235菌株商业化生产PUFA和类胡萝卜素的应用研究打下基础。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 绪论
•   1.1 微生物对多种环境胁迫的适应机制
•     1.1.1 微生物对高盐及渗透压胁迫的主要适应机制
•     1.1.2 微生物对低温胁迫的主要适应机制
•     1.1.3 微生物对氧化胁迫的主要适应机制
•   1.2 蛋白磷酸化激酶信号途径
•     1.2.1 MAPK信号通路
•     1.2.2 酵母中的MAPK信号通路
•     1.2.3 Hog1-MAPK信号通路
•   1.3 基因敲除系统简介
•   1.4 酵母遗传转化体系
•     1.4.1 LiAc遗传转化体系
•     1.4.2 根癌农杆菌介导的遗传转化体系
•     1.4.3 电击转化法
•   1.5 选题依据和技术路线
•     1.5.1 选题依据
•     1.5.2 研究背景及意义
•     1.5.3 技术路线
• 第二章 红冬孢酵母YM25235 菌株的RKHog1 基因敲除
•   2.1 材料
•     2.1.1 菌株与质粒
•     2.1.2 试剂、试剂盒和培养基
•     2.1.3 引物合成和测序
•   2.2 方法
•     2.2.1 YM25235 菌株RKHog1 基因组同源臂的PCR扩增
•       2.2.1.1 YM25235 菌株基因组DNA的提取
•       2.2.1.2 RKHog1 基因组序列同源臂的扩增
•       2.2.1.3 RKHog1-A和 RKHog1-B两个扩增片段回收
•       2.2.1.4 RKHog1-A和 RKHog1-B两个回收片段测序验证
•     2.2.2 RKHog1 基因敲除载体的构建
•       2.2.2.1 RKHog1 基因同源臂的扩增
•       2.2.2.2 RKHog1-A和 RKHog1-B两个基因片段的回收纯化
•       2.2.2.3 质粒pRH2034 的提取
•       2.2.2.4 RKHog1-A片段与质粒pRH2034 的连接与鉴定
•       2.2.2.5 RKHog1-B片段与重组质粒pRHRKHog1（A）的连接与鉴定
•     2.2.3 RKHog1 基因敲除YM25235 突变株的筛选
•       2.2.3.1 RKHog1 基因敲除片段的扩增
•       2.2.3.2 RKHog1 基因敲除片段的回收纯化
•       2.2.3.3 RKHog1 基因敲除片段转化红冬孢酵母YM25235 菌株
•       2.2.3.4 RKHog1 基因敲除突变株的筛选验证
•   2.3 结果与分析
•     2.3.1 RKHog1 基因同源臂的扩增
•     2.3.2 RKHog1 基因敲除载体的构建
•     2.3.3 RKHog1 基因敲除突变株的筛选
•   2.4 讨论
• 第三章 RKHog1 基因敲除对YM25235 菌株盐胁迫、渗透压和低温生长的影响
•   3.1 材料
•     3.1.1 菌株与质粒
•     3.1.2 试剂和培养基
•     3.1.3 引物合成和测序
•   3.2 方法
•     3.2.1 重组质粒pRHG418 的构建
•       3.2.1.1 G418 基因的扩增
•       3.2.1.2 G418 基因片段的回收纯化
•       3.2.1.3 G418 基因片段与质粒pRH2034 的连接与重组质粒鉴定
•     3.2.2 RKHog1 基因回补载体p RGRKHog1 的构建
•       3.2.2.1 RKHog1 基因的扩增
•       3.2.2.2 RKHog1 基因片段的回收纯化
•       3.2.2.3 RKHog1 基因与质粒pRHG418 的连接与鉴定
•     3.2.3 YM25235 菌株G418 最低抑制浓度分析
•     3.2.4 RKHog1 基因回补YM25235RKHog1Δ突变菌株的构建
•       3.2.4.1 重组质粒p RGRKHog1 转化YM25235RKHog1Δ突变菌株
•       3.2.4.2 RKHog1 基因回补的YM25235RKHog1Δ突变菌株的筛选
•     3.2.5 RKHog1 基因敲除对YM25235 菌株盐胁迫及高渗透压胁迫耐受性的影响
•       3.2.5.1 RKHog1 基因敲除对YM25235 菌株NaCl胁迫耐受性的影响
•       3.2.5.2 RKHog1 基因敲除对YM25235 菌株高渗透压胁迫耐受性的影响
•       3.2.5.3 NaCl胁迫条件下RKHog1 基因敲除对YM25235 菌株甘油合成的影响
•       3.2.5.4 高渗透压胁迫条件下RKHog1 基因敲除对YM25235 菌株甘油合成的影响
•     3.2.6 RKHog1 基因敲除对YM25235 菌株低温生长适应性的影响
•       3.2.6.1 RKHog1 基因敲除对YM25235 菌株低温生长的影响
•       3.2.6.2 低温条件下RKHog1 基因敲除对YM25235 菌株甘油合成的影响
•     3.2.7 刚果红和SDS压力条件下RKHog1 基因敲除对YM25235 菌株生长的影响
•     3.2.8 RKHog1 基因敲除对YM25235 菌株生长的影响
•     3.2.9 低温条件下RKHog1 基因敲除对YM25235 菌株多不饱和脂肪酸合成的影响
•       3.2.9.1 脂肪酸提取样品的处理
•       3.2.9.2 脂肪酸的提取
•       3.2.9.3 脂肪酸气相色谱分析
•       3.2.9.4 mRNA表达水平分析样品的处理
•       3.2.9.5 总RNA的提取
•       3.2.9.6 总RNA反转录成cDNA
•       3.2.9.7 RKHog1 基因mRNA转录水平的分析
•       3.2.9.8 RKHog1 敲除对Δ12/15-脂肪酸脱氢酶基因RKD12的mRNA转录水平的影响
•       3.2.9.9 RKHog1 敲除对锌指转录因子RKMsn4 mRNA转录水平的影响
•       3.2.9.10 RKHog1 敲除对组氨酸激酶基因RKHisK2301 mRNA转录水平的影响
•       3.2.9.11 RKHog1 敲除对G1 期细胞周期蛋白基因RKCLN1 mRNA转录水平的影响
•     3.2.10 RKHog1蛋白与锌指转录因子RKMsn4相互作用分析
•       3.2.10.1 酵母双杂交表达载体 pGADRKHog1 和 pGBKRKMsn4 的构建
•       3.2.10.2 重组质粒 pGADRKHog1 和 pGBKRKMsn4 转化Y2H 酵母菌株
•       3.2.10.3 RKHog1蛋白与锌指转录因子RKMsn4 相互作用分析
•     3.2.11 低温条件下RKHog1基因敲除对YM25235菌株RKHog1 蛋白磷酸化水平的影响
•       3.2.11.1 红冬孢酵母 YM25235 总蛋白的提取
•       3.2.11.2 标准曲线的绘制及蛋白质浓度的测定
•       3.2.11.3 RKHog1 蛋白磷酸化水平
•   3.3 结果与分析
•     3.3.1 重组质粒pRHG418 的构建
•     3.3.2 RKHog1 回补突变载体p RGRKHog1 的构建
•     3.3.3 YM25235 菌株G418 最低抑制浓度分析
•     3.3.4 RKHog1 基因回补YM25235RKHog1Δ突变株的筛选
•     3.3.5 RKHog1 基因敲除对YM25235 菌株的盐胁迫和渗透压胁迫耐受性分析
•       3.3.5.1 RKHog1 基因敲除降低了YM25235 菌株NaCl胁迫的耐受性
•       3.3.5.2 RKHog1 基因敲除降低了YM25235 菌株渗透压胁迫的耐受性
•       3.3.5.3 NaCl胁迫条件下RKHog1 基因敲除对YM25235 菌株甘油合成的影响
•       3.3.5.4 渗透压胁迫条件下RKHog1 基因敲除对YM25235 菌株甘油合成的影响
•     3.3.6 RKHog1 基因敲除明显降低了YM25235 菌株的低温生长适应性
•       3.3.6.1 RKHog1 基因敲除降低了YM25235 菌株的低温生长适应性
•       3.3.6.2 低温条件下RKHog1 基因敲除对YM25235 菌株的甘油合成的影响..
•     3.3.7 刚果红和SDS压力条件下RKHog1 基因敲除抑制了YM25235 菌株的生长
•     3.3.8 RKHog1 基因敲除影响了YM25235 菌株的生长
•     3.3.9 低温条件下RKHog1 基因敲除对YM25235 菌株多不饱和脂肪酸合成的影响
•       3.3.9.1 低温条件下RKHog1 基因敲除对YM25235 菌株脂肪酸含量变化的影响
•       3.3.9.2 低温条件下RKHog1 基因m RNA转录水平分析
•       3.3.9.3 RKHog1 基因敲除对Δ12/15-脂肪酸脱氢酶基因RKD12的mRNA转录水平的影响
•       3.3.9.4 RKHog1 基因敲除对锌指转录因子RKMsn4 mRNA转录水平的影响..
•       3.2.9.5 RKHog1 基因敲除对组氨酸激酶基因RKHisK2301 mRNA转录水平的影响
•     3.3.10 RKHog1 基因敲除对G1 期细胞周期蛋白基因RKCLN1 mRNA转录水平的影响
•     3.3.11 低温条件下RKHog1 基因敲除对YM25235 菌株RKHog1 蛋白磷酸化水平的影响
•     3.3.12 低温条件下RKHog1 基因敲除对YM25235 菌株RKHog1蛋白磷酸化水平的影响
•   3.4 讨论
• 第四章 RKHog1 基因敲除对YM25235 菌株类胡萝卜素合成的影响
•   4.1 材料
•     4.1.1 菌种
•     4.1.2 主要试剂和培养基
•     4.1.3 引物合成和测序
•   4.2 方法
•     4.2.1 RKHog1 基因敲除对YM25235 菌株类胡萝卜素合成的影响
•       4.2.1.1 类胡萝卜素提取样品的处理
•       4.2.1.2 类胡萝卜素的提取
•       4.2.1.3 用于mRNA转录水平分析样品的处理
•       4.2.1.4 总RNA的提取和反转录
•       4.2.1.5 类胡萝卜素合成相关基因的mRNA转录水平分析
•     4.2.2 RKHog1 基因敲除对YM25235 菌株油脂合成的影响
•       4.2.2.1 油脂提取样品的处理
•       4.2.2.2 油脂的提取
•   4.3 结果与分析
•     4.3.1 RKHog1 基因敲除对YM25235 菌株类胡萝卜素合成的影响
•     4.3.2 RKHog1 基因敲除对类胡萝卜素合成相关基因mRNA转录水平的影响
•     4.3.3 RKHog1 基因敲除对YM25235 菌株油脂合成的影响
•   4.4 讨论
• 第五章 总结与展望
• 致谢
• 参考文献
• 附录 A 攻读硕士学位期间发表的论文和专利
• 附录 B 实验所用溶液的配方
• 附录 C 实验所用仪器设备

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 李珊

导师: 张琦

关键词: 红冬孢酵母,环境胁迫,基因,基因敲除,低温生长适应性,多不饱和脂肪酸,类胡萝卜素

来源: 昆明理工大学

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学

单位: 昆明理工大学

分类号: Q935

DOI: 10.27200/d.cnki.gkmlu.2019.001838

总页数: 119

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