传染性胸膜肺炎放线杆菌（7型）AdhE蛋白的原核表达及其免疫保护性研究

论文摘要

胸膜肺炎放线杆菌（Actinobacillus pleuropneumoniae,App）是引起猪胸膜肺炎的病原体,胸膜肺炎是一种具有高度传染性的严重猪疾病,对全球各地的养殖业均造成了巨大的经济损失。猪胸膜肺炎以急性出血及慢性纤维素性胸膜肺炎为特征,可通过接触传染。AdhE是一种双功能酶,具有乙醛脱氢酶和乙醇脱氢酶的催化活性。近年来,大量研究结果表明AdhE在细菌感染宿主的过程中也发挥着重要调控作用。本试验以App 7型菌株感染小鼠肺组织后通过互作转录组分析获得的差异表达基因为前提,选取上调基因中差异表达倍数最高的基因AdhE作为研究对象。对该基因所编码的AdhE蛋白进行了基因克隆和原核表达,对该重组蛋白的免疫原性及其对小鼠的免疫保护作用进行了探究。1.App7型AdhE蛋白的原核表达及其免疫原性分析通过扩增App7型菌株的AdhE全基因,对其所编码的蛋白进行生物信息学分析,发现该蛋白高度保守。为了分析AdhE蛋白的免疫原性,本试验成功构建pET-32a（+）-AdhE大肠杆菌表达载体,于大肠杆菌BL21中表达,成功表达大小约为110kDa的蛋白。以纯化的rAdhE蛋白免疫小鼠制备多克隆抗体,结果显示在加强免疫后的小鼠血清中能检测到较高的IgG抗体水平,抗体滴度的对数值能达到lg=4.609,Western blot特异性检测结果显示,多克隆抗体中含有高水平抗rAdhE特异性抗体,进一步证明AdhE具有很强的免疫原性。2.App7型AdhE蛋白的免疫保护性分析本试验通过小鼠的攻毒保护性试验、肺组织病理切片分析以及监测以非致死剂量App感染小鼠前和感染后4、8、12、24、48h小鼠的细胞因子表达水平,对App的AdhE蛋白能否对App感染小鼠提供有效的免疫保护力进行评估。以致死剂量App7型或App1型菌株腹腔注射攻毒试验小鼠,结果显示PBS组小鼠均在36h内全部死亡,rAdhE组小鼠分别能获得获得90%（App7）或70%（App1）的保护力,保护力均略低于疫苗组的100%。组织病理学观察结果显示,相较于PBS组小鼠肺组织严重病变呈间质性肺炎且组织中有大量炎性细胞浸润,rAdhE组小鼠的肺组织病变较为轻微,仅肺泡壁以及支气管周围可见少量以中性粒细胞为主的炎性浸润,但是rAdhE组小鼠肺组织中的炎性细胞数量仍然略高于疫苗组免疫的小鼠肺组织。细胞因子监测结果发现,rAdhE组小鼠在感染App前即可诱导机体产生IFN-γ,激活宿主的天然免疫;在感染App初期4h内,PBS组和rAdhE组三种细胞因子相较感染前均呈现出显著高表达现象,小鼠为应对急性炎症而刺激机体产生大量炎性细胞因子;随着感染病程的发展,可明显观察到相较于PBS组小鼠,rAdhE组的小鼠IL-6、TNF-α和IFN-γ的表达显著受到了抑制,使得小鼠在感染12h内便将炎症反应控制在较低的水平,表明AdhE具有良好的免疫调节作用,通过调控小鼠体内IL-6、TNF-α和IFN-γ细胞因子的含量有效控制了细菌感染后的炎症反应。本研究证明了高度保守的AdhE蛋白具有良好的免疫原性以及免疫调节作用,具有抗App1和App7感染的交叉免疫保护作用。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 缩略词
• 第一章 文献综述
•   1 猪胸膜肺炎放线杆菌概述
•     1.1 App菌株的流行病学
•     1.2 胸膜肺炎放线杆菌的发病机制
•     1.3 App感染宿主的免疫反应
•       1.3.1 App感染的先天免疫反应
•       1.3.2 App感染的体液免疫反应
•       1.3.3 App感染细胞介导的免疫反应
•     1.4 App疫苗的研究进展
•       1.4.1 灭活疫苗
•       1.4.2 减毒活疫苗
•       1.4.3 亚单位疫苗
•     1.4.3.1 细菌LPS和基于多糖疫苗
•     1.4.3.2 基于蛋白质的疫苗
•       1.4.4 DNA疫苗
•   2 AdhE参与细菌与宿主互作的研究进展
•     2.1 细菌中的AdhE简介
•     2.2 AdhE参与细菌与宿主互作的机制研究
•     2.3 AdhE参与调控细菌感染宿主的致病机制
•     2.4 AdhE参与细菌对宿主免疫功能的调节
•   3 研究的目的与意义
• 第二章 App7型AdhE蛋白的原核表达及其免疫原性分析
•   1 实验材料
•     1.1 实验菌株、质粒与实验动物
•     1.2 实验试剂
•       1.2.1 产品试剂
•       1.2.2 配制试剂
•     1.3 主要仪器
•   2 试验方法
•     2.1 AdhE基因的扩增与序列分析
•       2.1.1 引物设计
•       2.1.2 App7 的培养及其基因组DNA的提取
•       2.1.3 App7 AdhE基因的PCR扩增
•       2.1.4 AdhE基因与原核表达载体pET-32a（+）连接
•       2.1.5 AdhE基因扩增片段测序与基因序列分析
•     2.2 AdhE蛋白基因的氨基酸生物信息学分析
•     2.3 rAdhE的制备与纯化
•       2.3.1 原核表达载体pET-32a（+）-AdhE的表达
•       2.3.2 重组蛋白rAdhE诱导表达的条件优化
•       2.3.3 rAdhE的制备
•       2.3.4 rAdhE的纯化及内毒素去除
•     2.4 App7 AdhE蛋白的多克隆抗体的制备
•     2.5 rAdhE的特异性检测
•     2.6 抗体效价检测
•     2.7 数据分析
•   3 实验结果
•     3.1 AdhE全基因的扩增
•     3.2 AdhE蛋白原核表达载体的构建及测序鉴定
•     3.3 AdhE基因序列比对分析
•     3.4 AdhE蛋白基因的氨基酸生物信息学分析
•       3.4.1 AdhE蛋白基因的核酸序列和氨基酸序列理化特性分析
•       3.4.2 AdhE蛋白氨基酸序列的结构域预测分析
•       3.4.3 AdhE蛋白氨基酸序列的多序列比较
•       3.4.4 AdhE蛋白氨基酸序列的信号肽序列预测
•       3.4.5 AdhE蛋白氨基酸序列的跨膜区域预测
•     3.5 AdhE蛋白原核表达载体rpET-32a（+）-AdhE的诱导表达、纯化及特异性鉴定
•     3.6 多克隆抗体的检测及其效价分析
•   4 讨论
•   5 小结
• 第三章 App7型AdhE蛋白的免疫保护性分析
•   1 实验材料
•     1.1 实验菌株、质粒
•     1.2 疫苗与实验动物
•     1.3 实验试剂
•       1.3.1 产品试剂
•       1.3.2 配制试剂
•     1.4 主要仪器
•   2 试验方法
•     2.1 rAdhE蛋白的表达及纯化
•     2.2 rAdhE对小鼠的免疫保护试验
•     2.3 细菌的回收鉴定试验
•     2.4 组织病理学分析
•     2.5 ELISA测定细胞因子
•     2.6 数据分析
•   3 结果
•     3.1 rAdhE对小鼠的攻毒保护结果
•     3.2 组织病理学分析
•     3.3 细菌的回收鉴定试验
•     3.4 细胞因子的测定
•   4 讨论
• 全文总结
• 参考文献
• 致谢
• 作者简历

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 蔡瑶

导师: 徐志文

关键词: 猪传染性胸膜肺炎放线杆菌,双功能乙醛,乙醇脱氢酶,免疫原性,免疫保护性

来源: 四川农业大学

年度: 2019

分类: 基础科学,农业科技

专业: 生物学,畜牧与动物医学

单位: 四川农业大学

分类号: S852.61

DOI: 10.27345/d.cnki.gsnyu.2019.000888

总页数: 73

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