人致病性呼肠孤病毒μNS互作蛋白的筛选与鉴定

论文摘要

目的:通过免疫荧光技术应用共聚焦显微镜观察纳尔逊海湾病毒（NBV）感染的细胞中μNS蛋白的定位情况。通过免疫荧光技术应用共聚焦显微镜观察单独转染M3质粒的细胞中μNS蛋白的形成包涵体的情况。利用质谱分析技术对人致病性呼肠孤病毒μNS蛋白的宿主互作蛋白进行筛选及分析鉴定,明确未知蛋白的氨基酸序列及结构,推断其在病毒感染复制过程中的作用,为深入研究纳尔逊海湾病毒及正呼肠孤病毒对人类致病机制提供理论依据。方法:本研究通过免疫荧光方法在共聚焦显微镜下观察了μNS蛋白在NBV感染的细胞中的定位。为了确定μNS蛋白在病毒包涵体样结构中定位,本研究将人致病性呼肠孤病毒以0.1PFU/细胞的感染复数（MOI）感染了L929细胞,孵育24小时,先后用μNS多克隆抗体和Alexa 488的羊抗兔抗体对μNS蛋白进行免疫染色,免疫染色后用共聚焦显微镜观察。为了证明当在没有其他NBV病毒蛋白表达的情况下,μNS可以形成病毒包涵体样结构,本研究用pEFHAMBM3质粒（含有来自NBV病毒的M3基因的表达载体）转染L929细胞,通过免疫荧光的方法在共聚焦显微镜下观察μNS在细胞中的分布。为了得到人致病性呼肠孤病毒的μNS蛋白及其互作蛋白,本研究将构建好的载有M3基因片段的质粒pEFHAMBM3转染至293T细胞中去,pEFHA空质粒作为对照。通过免疫沉淀的方法得到M3基因片段编码的μNS蛋白及其可能与之互作的宿主蛋白,将实验组及对照组蛋白分别进行蛋白质定性检测（Shotgun）,分析差异蛋白。结果:免疫染色后共聚焦显微镜观察可见人致病性呼肠孤病毒感染的细胞中μNS蛋白以类似的点状的致密结构呈现,这种小的点状致密结构即为包涵体样结构,提示μNS蛋白在包涵体样结构中定位,将单独转染M3质粒的细胞进行免疫染色后,用共聚焦显微镜观察可见与人致病性呼肠孤病毒感染细胞中包涵体样结构一致的点状致密结构,提示μNS蛋白独自表达即可形成包涵体样结构。对实验组及对照组蛋白样本进行蛋白质定性检测,对比后得到9种差异表达蛋白:丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶、精氨合酶、角蛋白14、线粒体Rho GTPase 1、组蛋白H2B、40S核糖体蛋白S4、核糖体蛋白L26、肌动蛋白-2、未表征的蛋白质。结论:人致病性呼肠孤病毒的μNS蛋白定位于病毒感染细胞的包涵体结构中。人致病性呼肠孤病毒的μNS蛋白在M3质粒单独转染细胞中即可独立表达且在没有任何其他病毒蛋白表达时即具有形成包涵体样结构的能力。丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶、精氨合酶、角蛋白14、线粒体Rho GTPase 1、组蛋白H2B、40S核糖体蛋白S4、核糖体蛋白L26、肌动蛋白-2、未表征的蛋白质这9种蛋白质其中的一种或几种可能通过和μNS蛋白相互作用参与了呼肠孤病毒的增殖过程。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 英文缩略语
• 1 前言
• 2 材料与方法
•   2.1 主要仪器与实验材料
•     2.1.1 实验材料
•     2.1.2 实验仪器
•   2.2 实验方法
•     2.2.1 细胞培养
•     2.2.2 质粒转染
•     2.2.3 病毒感染
•     2.2.4 免疫荧光
•     2.2.5 蛋白样本制备
•     2.2.6 免疫沉淀
•     2.2.7 免疫印迹实验
•     2.2.8 镀银染色
•     2.2.9 蛋白质谱分析
• 3 结果
•   3.1 蛋白免疫印迹检测转染后细胞内μNS的表达情况
•   3.2 免疫荧光确认uNS蛋白在MB病毒感染细胞及M3 转染细胞中的表达
•   3.3 蛋白印迹检测免疫沉淀后μNS的表达及其互作蛋白
•   3.4 SDS-PAGE电泳镀银染色检测μNS蛋白及其互作蛋白
•   3.5 蛋白质定性检测（Shotgun）
• 4 讨论
• 5 结论
• 本研究创新性的自我评价
• 参考文献
• 综述
•   参考文献
• 攻读学位期间取得的研究成果
• 致谢
• 个人简介

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 董晗

导师: 张军

关键词: 呼肠孤病毒,蛋白,包涵体,细胞宿主蛋白

来源: 中国医科大学

年度: 2019

分类: 基础科学,医药卫生科技

专业: 生物学,基础医学

单位: 中国医科大学

分类号: R373

DOI: 10.27652/d.cnki.gzyku.2019.000542

总页数: 47

文件大小: 1265K

下载量: 28