粘质沙雷氏菌膜结合葡萄糖酸脱氢酶的纯化、鉴定与表征

论文摘要

2-酮基-D-葡萄糖酸（2-keto-D-gluconic acid,2KGA）是抗氧化剂D-异抗坏血酸及其钠盐合成的前体物质,被广泛应用于食品、药品、化工等领域。膜结合葡萄糖酸脱氢酶（gluconate dehydrogenase,GADH）是2KGA生物合成过程中一种重要的氧化还原酶,为提高2KGA的生产效率,有必要对其进行深入研究。本论文以2KGA生产菌株粘质沙雷氏菌（Serratia marcescens）JUIM03为研究材料,利用Triton X-114两相分离技术和层析技术从该菌株中分离纯化膜结合GADH,随后采用SDS-PAGE、可见光吸收光谱和MALDI-TOF-MS技术对纯化的蛋白进行分析,同时利用高效液相色谱和红外光谱技术对其催化氧化葡萄糖酸的产物进行鉴定,并系统研究膜结合GADH的酶学特性。在此基础上,采用LA-PCR（long and accurate polymerase chain reaction）技术克隆膜结合GADH的基因,并利用生物信息学在线分析工具和相关软件明确膜结合GADH蛋白的生物学信息。主要研究结果如下:（1）通过超声破碎细胞、Triton X-114两相分离、盐析、DEAE-sepharose阴离子交换层析和羟基磷灰石吸附层析等步骤,从粘质沙雷氏菌JUIM03中获得比活为91.43 U/mg、纯化倍数为160倍及回收率为3.8%的膜结合GADH。SDSPAGE分析结果表明,纯化获得的膜结合GADH由三个亚基组成,其中大亚基为含有FAD的分子质量约为65.0 k Da的黄素蛋白,中亚基和小亚基的分子质量分别约为45.0 k Da和23.0 k Da。可见光吸收光谱和MALDI-TOF-MS分析结果进一步表明,从粘质沙雷氏菌JUIM03中纯化的GADH确实为FAD依赖性的膜结合GADH。高效液相色谱和红外光谱分析结果表明,粘质沙雷氏菌膜结合GADH催化氧化葡萄糖酸的产物为2KGA。（2）酶学性质研究结果表明,粘质沙雷氏菌JUIM03膜结合GADH的最适反应温度为40°C,最适反应p H值为5.0,且在3040°C和p H 5.07.0之间具有较好的稳定性;Na+对膜结合GADH活性没有影响,Mg2+对该酶具有促进作用,而Mn2+、Ni2+、Cd2+、Cu2+、Zn2+、Fe3+等金属离子对该酶均有不同程度的抑制作用;变性剂巯基乙醇和SDS对膜结合GADH均有不同程度的抑制作用;EDTA对膜结合GADH的催化活性基本没有影响;有机酸如乙醇酸、乙醛酸和2KGA对膜结合GADH的催化活性基本没有影响,而草酸和草氨酸对该酶具有强烈的抑制作用;甲醇、丙酮、异丙醇和乙醇等有机溶剂对膜结合GADH活性均有不同程度的抑制作用;来源于粘质沙雷氏菌JUIM03膜结合GADH具有严格的底物特异性,即只有在D-葡萄糖酸作为底物时才具有催化活性,其Km值为1.33mmol/L。（3）采用LA-PCR技术从粘质沙雷氏菌JUIM03中克隆了葡萄糖酸脱氢酶操纵子（gad操纵子）的全长序列。生物信息学分析结果表明,gad操纵子具有三个结构基因,依次为gnd S、gnd L和gnd C,相对应的核苷酸序列长度分别为729bp、1782 bp和1338 bp。gnd S基因与S.marcescens SGAir0764葡萄糖酸脱氢酶小亚基基因序列的一致性为98%,其编码的蛋白属于gluconate2-dh3 superfamily,为跨膜蛋白;基因gnd L与S.marcescens UMH8葡萄糖酸脱氢酶大亚基基因序列的一致性为99%,其编码的蛋白属于GMCoxredC superfamily,为跨膜蛋白;基因gnd C与S.marcescens UMH8葡萄糖酸脱氢酶中亚基基因序列的一致性为99%,其编码的蛋白属于cytochrom?C superfamily,无跨膜结构域。

论文目录

• 摘要
• abstract
• 英文缩略表
• 第一章 绪论
•   1.1 粘质沙雷氏菌的相关研究进展
•     1.1.1 粘质沙雷氏菌简介
•     1.1.2 粘质沙雷氏菌的葡萄糖代谢及其发酵工业中的应用
•     1.1.3 粘质沙雷氏菌的2KGA合成代谢
•   1.2 FAD依赖性膜结合葡萄糖酸脱氢酶相关研究进展
•     1.2.1 FAD依赖性膜结合GADH的来源与结构
•     1.2.2 FAD依赖性膜结合GADH的纯化
•     1.2.3 膜结合GADH的克隆表达
•   1.3 膜蛋白概述
•     1.3.1 膜蛋白的定义与分类
•     1.3.2 TritonX-114 两相分离膜蛋白
•     1.3.3 膜蛋白的纯化技术
•   1.4 立题背景及意义
•   1.5 研究的主要内容
• 第二章 粘质沙雷氏菌膜结合GADH的分离纯化与初步鉴定
•   2.1 实验材料
•     2.1.1 菌株
•     2.1.2 实验材料与仪器设备
•     2.1.3 培养基
•   2.2 实验方法
•     2.2.1 粘质沙雷氏菌JUIM03 细胞生长曲线的测定
•     2.2.2 粘质沙雷氏菌膜结合GADH的分离纯化
•     2.2.3 粘质沙雷氏菌膜结合GADH的电泳检测
•     2.2.4 粘质沙雷氏菌膜结合GADH的吸收光谱分析
•     2.2.5 粘质沙雷氏菌膜结合GADH的 MALDI-TOF-MS分析
•     2.2.6 粘质沙雷氏菌膜结合GADH催化氧化D-葡萄糖酸所形成产物的分析
•   2.3 结果与讨论
•     2.3.1 粘质沙雷氏菌JUIM03 生长曲线的变化分析
•     2.3.2 粘质沙雷氏菌膜结合GADH的分离纯化
•     2.3.3 粘质沙雷氏菌膜结合GADH的 SDS-PAGE分析
•     2.3.4 粘质沙雷氏菌膜结合膜结合GADH在可见光区的吸收光谱分析
•     2.3.5 粘质沙雷氏菌膜结合GADH的 MALDI-TOF-MS分析
•     2.3.6 粘质沙雷氏菌膜结合GADH催化GA形成产物的鉴定
•   2.4 本章小结
• 第三章 粘质沙雷氏菌膜结合GADH的酶学性质
•   3.1 实验材料和仪器
•     3.1.1 主要试剂和材料
•     3.1.2 主要仪器与设备
•   3.2 实验方法
•     3.2.1 粘质沙雷氏菌膜结合GADH的制备及活性测定
•     3.2.2 粘质沙雷氏菌膜结合GADH最适反应温度的测定
•     3.2.3 粘质沙雷氏菌膜结合GADH的热稳定性测定
•     3.2.4 粘质沙雷氏菌膜结合GADH的最适反应pH及 pH稳定性测定
•     3.2.5 金属离子对粘质沙雷氏菌膜结合GADH催化反应活性的影响
•     3.2.6 变性剂和EDTA对粘质沙雷氏菌膜结合GADH催化活性的影响
•     3.2.7 有机酸对粘质沙雷氏菌膜结合GADH催化活性的影响
•     3.2.8 有机溶剂对粘质沙雷氏菌膜结合GADH催化活性的影响
•     3.2.9 粘质沙雷氏菌膜结合GADH的底物特异性实验
•     3.2.10 粘质沙雷氏菌膜结合GADH催化反应动力学常数的测定
•   3.3 结果与讨论
•     3.3.1 粘质沙雷氏菌膜结合GADH的最适反应温度
•     3.3.2 粘质沙雷氏菌膜结合GADH的热稳定性
•     3.3.3 粘质沙雷氏菌膜结合GADH的最适反应pH
•     3.3.4 粘质沙雷氏菌膜结合GADH的 pH稳定性
•     3.3.5 金属离子对粘质沙雷氏菌膜结合GADH活性的影响
•     3.3.6 变性剂和EDTA对粘质沙雷氏菌膜结合GADH活性的影响
•     3.3.7 有机酸对粘质沙雷氏菌膜结合GADH催化活性的影响
•     3.3.8 有机溶剂对粘质沙雷氏菌膜结合GADH活性的影响
•     3.3.9 粘质沙雷氏菌膜结合GADH的底物特异性
•     3.3.10 粘质沙雷氏菌膜结合GADH的酶促反应动力学参数
•     3.3.11 不同微生物来源的膜结合 GADH 的比较
•   3.4 本章小结
• 第四章 粘质沙雷氏菌膜结合GADH基因的克隆与生物信息学分析
•   4.1 实验材料
•     4.1.1 菌株和质粒
•     4.1.2 生化试剂与溶液
•     4.1.3 主要仪器与设备
•   4.2 实验方法
•     4.2.1 粘质沙雷氏菌基因组DNA的提取
•     4.2.2 PCR引物的设计与合成
•     4.2.3 目的基因片段的扩增与回收
•     4.2.4 大肠杆菌感受态细胞的制备
•     4.2.5 重组质粒的构建
•     4.2.6 大肠杆菌JM109 感受态细胞的转化
•     4.2.7 重组质粒的验证
•     4.2.8 粘质沙雷氏菌gad操纵子的生物信息学分析
•   4.3 实验结果及分析
•     4.3.1 粘质沙雷氏菌gad操纵子的克隆
•     4.3.2 重组质粒的构建与验证
•     4.3.3 粘质沙雷氏菌gad操作子结构基因的组分分析
•     4.3.4 粘质沙雷氏菌gad操作子中各结构基因的生物信息学分析
•   4.4 本章小结
• 第五章 结论与展望
•   5.1 主要结论
•   5.2 存在问题与展望
• 参考文献
• 致谢
• 攻读硕士学位期间发表的论文

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 王贝贝

导师: 孙文敬

关键词: 粘质沙雷氏菌,葡萄糖酸脱氢酶,纯化,酶学性质,克隆

来源: 江苏大学

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学

单位: 江苏大学

分类号: Q936

总页数: 95

文件大小: 4075K

下载量: 34