C1QBP抑制PCV2增殖的分子机制

论文摘要

猪圆环病毒2型（Porcine circovirus type 2,PCV2）是引起猪圆环病毒相关病（Porcine circovirus associated disease,PCVAD）的主要病原。PCV2在分类上属于圆环病毒科（Circoviridae）圆环病毒属（Circovirus）,为闭合单链环状DNA。PCV2基因组全长为1767bp或1768bp,至少可以编码11个开放阅读框（Open reading frame,ORF）。ORF1编码病毒的复制酶Rep和Rep,蛋白,参与PCV2的复制。ORF2编码的衣壳蛋白Cap可以自动组装成病毒样颗粒（Virus-like particles,VLPs）,其N端含有一段核定位信号（Nuclear localization signal,NLS）,可以引导Cap蛋白进入细胞核,Cap蛋白入核对PCV2的增殖有重要影响作用。前期通过酵母双杂交实验,我们筛选到了与Cap蛋白互作的宿主补体1q结合蛋白（Complement component 1q subcomponent binding protein,C1QBP）。激光共聚焦结果显示C1QBP与Cap蛋白在细胞核周围发生互作,并改变了Cap蛋白的细胞内定位;过表达C1QBP可以显著抑制PCV2的增殖,据此我们推测,C1QBP可能是通过抑制Cap蛋白的入核发挥了抗病毒作用。为证实这一推论,我们用入核抑制剂——伊维菌素抑制Cap蛋白的入核,以揭示抑制入核对PCV2增殖的影响,在此基础上通过过表达Cap和CapNLS进一步研究了C1QBP抑制PCV2增殖的分子机制。研究获得以下结果:（1）用伊维菌素处理PCV2感染的PK-15细胞,可以显著抑制PCV2的增殖,实时定量检测结果显示伊维菌素处理24 h和48 h,可将PCV2 mRNA表达量降低61%和81%。（2）用伊维菌素处理过表达Cap和CapNLS的细胞,发现伊维菌素可以阻止Cap和CapNLS进入细胞核;伊维菌素处理改变了Cap和CapNLS的细胞内定位,从而证实伊维菌素对Cap的作用位点可能是NLS。（3）在PK-15细胞上过表达C1QBP可以抑制PCV2的增殖,在感染后24 h和48h,过表达C1QBP可以将PCV2 mRNA表达量减少59%和28%。（4）C1QBP可以与Cap和CapNLS发生互作,抑制Cap和CapNLS进入细胞核,改变了Cap和CapNLS的细胞内定位,C1QBP对Cap的作用靶点可能是CapNLS。（5）在PK-15细胞内过表达CapNLS可以促进PCV2增殖,但过表达CapNLS对Cap入核发挥了抑制作用,提示更多复杂的因素参与了Cap的入核。综上所述,我们证明了伊维菌素和C1QBP可以抑制PCV2的增殖,改变了PCV2结构蛋白Cap的细胞内定位,抑制其进入细胞核,但过表达CapNLS不能促进Cap蛋白入核,但能提高PCV2的增殖,提示更多复杂的机制参与了PCV2的增殖。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 文献综述
•   1.1 猪圆环病毒的研究进展
•     1.1.1 猪圆环病毒的发现及病原学特征
•     1.1.2 入核调控与PCV2增殖
•     1.1.3 PCV2的发病特征
•     1.1.4 PCV2的致病机制
•     1.1.5 PCV2的诊断和防控
•   1.2 补体1q结合蛋白（C1QBP）研究进展
•     1.2.1 C1QBP概述
•     1.2.2 C1QBP在组织中表达特点
•     1.2.3 C1QBP与癌症和病毒
•     1.2.4 C1QBP与PCV2感染
•   1.3 研究的目的及意义
• 第二章 C1QBP抑制PCV2的增殖
•   2.1 材料
•     2.1.1 菌株、细胞、毒株和质粒
•     2.1.2 主要试剂
•     2.1.3 主要仪器设备
•   2.2 方法
•     2.2.1 重组质粒的构建
•     2.2.2 重组质粒在真核细胞内表达验证
•     2.2.3 检测伊维菌素对PK-15细胞的最适浓度
•     2.2.4 伊维菌素和过表达C1QBP对PCV2增殖的影响
•     2.2.5 Cap蛋白表达以及PCV2感染对C1QBP表达的影响
•   2.3 结果
•     2.3.1 重组质粒鉴定
•     2.3.2 重组质粒表达情况鉴定
•     2.3.3 伊维菌素对PK-15细胞毒性检测
•     2.3.4 伊维菌素和过表达C1QBP对PCV2增殖的影响
•     2.3.5 PCV2 Cap蛋白和PCV2对C1QBP表达的影响
•   2.4 讨论
•   2.5 小结
• 第三章 C1QBP和Cap蛋白NLS互作抑制Cap蛋白入核
•   3.1 材料
•     3.1.1 菌株、细胞和质粒等
•     3.1.2 主要试剂
•     3.1.3 主要仪器设备
•   3.2 方法
•     3.2.1 重组质粒的构建
•     3.2.2 酵母双杂交验证C1QBP与Cap和CapNLS相互作用
•     3.2.3 免疫共沉淀验证C1QBP与Cap和CapNLS相互作用
•     3.2.4 激光共聚焦验证C1QBP与Cap和CapNLS在核周围互作
•     3.2.5 激光共聚焦验证伊维菌素与C1QBP抑制Cap和CapNLS入核
•     3.2.6 Western blot验证C1QBP抑制Cap和CapNLS入核
•   3.3 结果
•     3.3.1 重组质粒鉴定
•     3.3.2 酵母双杂交验证C1QBP与Cap和CapNLS相互作用
•     3.3.3 Co-IP验证C1QBP与Cap和CapNLS相互作用
•     3.3.4 激光共聚焦验证C1QBP与Cap和CapNLS在核周围互作
•     3.3.5 激光共聚焦验证伊维菌素和C1QBP抑制Cap和CapNLS入核
•     3.3.6 Western blot验证C1QBP抑制Cap和CapNLS入核
•   3.4 讨论
•   3.5 小结
• 第四章 CapNLS功能域促进PCV2增殖
•   4.1 材料
•     4.1.1 菌株、细胞、毒株和质粒
•     4.1.2 主要试剂
•     4.1.3 主要仪器设备
•   4.2 方法
•     4.2.1 过表达CapNLS结构域对PCV2增殖的影响
•     4.2.2 Western blot检测CapNLS对Cap入核的影响
•     4.2.3 激光共聚焦观察CapNLS对Cap入核的影响
•   4.3 结果
•     4.3.1 过表达CapNLS结构域对PCV2增殖的影响
•     4.3.2 Western blot检测CapNLS对Cap入核的影响
•     4.3.3 激光共聚焦观察CapNLS对Cap入核的影响
•   4.4 讨论
•   4.5 小结
• 结论
• 附录A 主要试剂和仪器
• 附录B 实验操作方法
• 参考文献
• 致谢
• 作者简介

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 吕长杰

导师: 杨增岐

关键词: 猪圆环病毒型,蛋白核定位信号,伊维菌素,病毒复制

来源: 西北农林科技大学

年度: 2019

分类: 基础科学,农业科技

专业: 生物学,畜牧与动物医学

单位: 西北农林科技大学

基金: PRRSV利用多变B-TRS高效转录亚基因组的独特机制研究基金(编号:31672581)

分类号: S852.651

总页数: 64

文件大小: 2463K

下载量: 84