几丁二糖脱乙酰酶的克隆表达与生物转化合成氨基葡萄糖的研究

论文摘要

氨基葡萄糖（GlcN）是一种天然小分子单糖,是当今世界上认可度较高的一种有效治疗骨关节疾病的药品、当作为膳食营养补充剂时能有效的减缓骨关节炎症。可广泛应用于医药、保健、农业及化妆品等领域。GlcN主要由甲壳素水解法和微生物发酵法制得,据报道,甲壳素水解法存在原材料受限,环境污染严重等问题,微生物发酵法存在产量低,菌体对GlcN不耐受等缺点。本研究利用几丁二糖脱乙酰酶（Dac）通过环境友好的生物催化法将底物GlcNAc高效水解为GlcN。首先,将来源于极端嗜热古菌（Pyrococcus horikoshii）的几丁二糖脱乙酰酶基因（Dac）在大肠杆菌及枯草芽孢杆菌成功实现胞内表达,利用催化活力更高的重组枯草芽孢杆菌B.subtili-Dac全细胞催化合成GlcN。同时,将Dac在枯草芽孢杆菌中进行高效分泌表达,经过信号肽筛选及启动子替换,获得最优信号肽YncM和启动子P43,胞外酶活力达到18.6 U?mL-1。在其构建质粒过程中获得了5’非翻译区（5’UTR）突变的质粒,构建出重组菌株BS-NMKmut-yncM-Dac,胞外酶活提高至1548.7 U?mL-1。在此基础上,将编号为C4的N端编码序列（NCS）融合在Dac基因的N端,构建出重组菌株BS-NMKmut-C4-yncM-Dac,胞外酶活提高至2015.3 U?mL-1。其次,通过定点饱和突变及高通量筛选技术获得催化活力明显提高的Dac突变体R157T,Km值从原来的6.75 mM降低为5.15 mM,Vmax值从4.94μM?s-1提高到7.56μM?s-1,比酶活从2047.3 U?mg-1提高到3112.2 U?mg-1。最后,对B.subtili-Dac/R157T进行全细胞催化条件优化,最优转化条件为:底物GlcNAc终浓度50 g?L-1,细胞添加量18.6 g?L-1,转化体系pH 7.5,温度40oC,催化时间3 h。在3-L发酵罐中GlcN产量最高达35.3 g?L-1,摩尔转化率为86.8%。利用BS-NMKmut-C4-yncM-Dac/R157T发酵上清液进行酶法脱乙酰合成GlcN的条件优化,最优转化条件:底物GlcNAc终浓度50 g?L-1,酶终浓度6000 U?mg-1,温度40oC,催化时间25 min。在1-L发酵罐中GlcN的产量达到35.4 g?L-1,转化率为87.4%。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 符号缩写
• 第一章 绪论
•   1.1 氨基葡萄糖
•     1.1.1 GlcN的结构
•     1.1.2 GlcN的性质
•     1.1.3 GlcN的应用
•   1.2 GlcN的生产方法
•     1.2.1 化学水解法
•     1.2.2 微生物发酵法
•     1.2.3 生物转化法
•   1.3 脱乙酰酶概述
•     1.3.1 几丁二糖脱乙酰酶脱乙酰反应
•     1.3.2 几丁二糖脱乙酰酶的来源与种类
•   1.4 异源基因表达系统
•     1.4.1 大肠杆菌表达系统
•     1.4.2 枯草芽孢杆菌表达系统
•     1.4.3 影响基因异源表达的因素
•   1.5 立题意义与研究内容
•     1.5.1 立题意义
•     1.5.2 研究内容
• 第二章 材料与方法
•   2.1 实验材料
•     2.1.1 实验试剂
•     2.1.2 实验仪器和设备
•     2.1.3 菌株与质粒
•     2.1.4 主要培养基
•     2.1.5 常用溶液的配置
•   2.2 分子生物学操作
•     2.2.1 感受态的制备
•     2.2.2 质粒DNA的提取及DNA片段的回收
•     2.2.3 一步法克隆
•     2.2.4 酶切和连接
•     2.2.5 总RNA的提取及c DNA的合成
•     2.2.6 荧光定量PCR
•   2.3 几丁二糖脱乙酰酶的异源胞内表达
•     2.3.1 重组质粒pET-28a-Dac的构建
•     2.3.2 重组质粒pET-28a-Dac的转化及重组大肠杆菌的诱导表达
•     2.3.3 重组质粒pP43NMK-Dac的构建
•     2.3.4 重组质粒pP43NMK-Dac的转化及重组枯草芽孢杆菌的发酵表达
•   2.4 几丁二糖脱乙酰酶的异源分泌表达
•     2.4.1 重组质粒pMA0911-Dac系列的构建
•     2.4.2 重组质粒pP43NMK-yncM-Dac的构建
•     2.4.3 基因N端融合N端编码序列的重组质粒构建
•     2.4.4 重组质粒的转化及重组枯草芽孢杆菌的发酵表达
•   2.5 几丁二糖脱乙酰酶的定向进化
•     2.5.1 计算机模拟分子对接
•     2.5.2 定点饱和突变及高通量筛选
•     2.5.3 几丁二糖脱乙酰酶的蛋白纯化
•     2.5.4 几丁二糖脱乙酰酶的动力学参数测定
•   2.6 生物法催化合成GlcN
•     2.6.1 几丁二糖脱乙酰酶的最适反应pH及反应温度研究
•     2.6.2 不同温度下GlcN的稳定性研究
•     2.6.3 全细胞催化合成GlcN
•     2.6.4 酶法脱乙酰合成GlcN
•   2.7 检测方法及数据分析
•     2.7.1 HPLC分析
•     2.7.2 几丁二糖脱乙酰酶的酶活力检测方法
•     2.7.3 蛋白SDS-PAGE分析
•     2.7.4 蛋白浓度检测
•     2.7.5 数据处理与统计分析
• 第三章 结果与讨论
•   3.1 几丁二糖脱乙酰酶基因的异源胞内表达
•     3.1.1 重组质粒pET-28a-Dac的构建
•     3.1.2 重组质粒pET-28a-Dac的转化和诱导表达
•     3.1.3 重组质粒pP43NMK-Dac的构建
•     3.1.4 重组质粒pP43NMK-Dac的转化和发酵表达
•   3.2 几丁二糖脱乙酰酶的分泌表达
•     3.2.1 信号肽的筛选
•     3.2.2 重组质粒pP43NMK-yncM-Dac的构建及表达
•     3.2.3 5'非翻译区突变质粒pP43NMKmut-yncM-Dac的获得
•     3.2.4 5'非翻译区突变对蛋白表达的影响
•     3.2.5 基因Dac转录水平的分析
•     3.2.6 N端编码序列（NCS）对蛋白表达的影响
•   3.3 几丁二糖脱乙酰酶的定向进化
•     3.3.1 分子对接及关键位点的选择
•     3.3.2 定点饱和突变及高通量筛选
•     3.3.3 目的蛋白的纯化及比酶活的测定
•     3.3.4 目的蛋白的动力学分析
•   3.4 生物法催化合成氨基葡萄糖
•     3.4.1 几丁二糖脱乙酰最适pH及最适温度研究
•     3.4.2 GlcN的稳定性研究
•     3.4.3 全细胞法催化合成GlcN
•     3.4.4 酶法脱乙酰合成GlcN
•     3.4.5 两种生物催化法合成GlcN的比较
• 主要结论与展望
• 致谢
• 参考文献
• 附录：作者在攻读硕士学位期间发表的论文
• 附录：附加材料

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 姜竹

导师: 刘龙

关键词: 氨基葡萄糖,乙酰氨基葡萄糖,几丁二糖脱乙酰酶,生物催化

来源: 江南大学

年度: 2019

分类: 基础科学,工程科技Ⅰ辑

专业: 生物学,有机化工,一般化学工业

单位: 江南大学

分类号: TQ925;TQ281

总页数: 73

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