利用CRISPR/Cas9技术构建稳定表达人白蛋白基因的中国仓鼠卵巢细胞系

论文摘要

通过目的基因的随机整合方式,构建得到的CHO表达细胞系,常会因为目的基因插入到染色体内不稳定区域,而在长期传代过程中出现表达不稳定的现象,这主要是由于位点效应所导致的。为了解决这个问题,现利用CRISPR/Cas9技术介导的同源重组,将目的基因直接整合于CHO细胞染色体上的稳定表达区域,以克服位点效应带来的CHO表达细胞系的长期表达不稳定。利用该技术总共获得了2株外源基因(人白蛋白基因)定点整合细胞系; Western blot结果显示,细胞上清液的产物具有人白蛋白抗原性;细胞在贴壁状态下,两株细胞系在第3、12、23、35、50代,细胞每日表达的HSA质量接近,且均维持在0. 5pg cell/d;选取一株表达细胞系,经悬浮驯化后,在批次条件培养下,第1、25、50代的悬浮细胞,在摇瓶内的表达浓度均稳定在13～14mg/L。显示了将外源基因定点整合于CHO细胞基因组内的可行性;且外源基因整合在稳定表达区域后,重组细胞系具有对外源基因长期表达的稳定性。

论文目录

• 1 材料与方法
•   1.1 材料与试剂
•   1.2 仪器与设备
•   1.3 实验方法
•     1.3.1 SgRNA表达质粒构建以及sgRNA引导Cas9靶向突变目标基因效率检测
•     1.3.2 细胞培养、转染及稳定细胞系构建
•     1.3.3 DNA的分离与PCR扩增
•     1.3.4 Western blot、ELISA检测与乳胶比浊检测
•     1.3.5 细胞悬浮驯化
• 2 结果与分析
•   2.1 位点可编辑性验证
•   2.2 通过定点整合方法构建外源基因靶向敲入细胞系
•   2.3 定点整合细胞系表达水平检测
•   2.4 细胞的悬浮驯化及批次表达
• 3 讨论

文章来源

类型: 期刊论文

作者: 周松涛,陈蕴,龚笑海,金坚,李华钟

关键词: 中国仓鼠卵巢细胞,定点整合,蛋白质表达

来源: 中国生物工程杂志 2019年04期

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学

单位: 江南大学生物工程学院,江南大学药学院

基金: 国家高技术研究发展计划(2014AA021003,2015AA020802)资助项目

分类号: Q78

DOI: 10.13523/j.cb.20190407

页码: 52-59

总页数: 8

文件大小: 488K

下载量: 223