猪细小病毒非结构蛋白1（NS1）诱导细胞凋亡致母猪流产的分子机制研究

论文摘要

猪细小病毒（Porcine parvovirus,PPV）是引起母猪繁殖障碍的重要病毒之一。PPV不仅感染母猪的胎盘组织,还可以通过胎盘屏障感染胎儿,引起母猪胎盘组织损伤和胎儿发育障碍,导致妊娠失败和流产。我室与其它实验室研究证实,PPV可诱导宿主细胞的凋亡和坏死,推测PPV诱导细胞凋亡与PPV感染引起妊娠母猪流产有关。为探讨PPV诱导细胞凋亡的分子机制,本研究在进一步确定PPV感染引起母猪流产与PPV诱导细胞凋亡有关的基础上,针对PPV编码的蛋白和宿主细胞凋亡的途径,分析和确定PPV诱导细胞凋亡的病毒蛋白,然后探讨该病毒蛋白诱导宿主细胞凋亡的分子机制。为确定PPV感染妊娠母猪引起流产是否与PPV诱导细胞凋亡和组织损伤有关,通过组织切片技术及HE和TUNEL染色法,分别检测了PPV感染所致妊娠猪流产的胎盘组织的病理变化和细胞凋亡。结果显示PPV感染可引起胎盘组织褶皱不同程度的断裂,上皮细胞（包括滋养层细胞）的脱落,以及组织间的充血,同时伴有严重的上皮细胞的凋亡和坏死,表明PPV感染引起妊娠母猪的流产与PPV诱导细胞的凋亡和坏死有关。为进一步证明PPV可诱导细胞的凋亡,本实验用PPV在体外感染PK-15宿主细胞,感染后利用流式细胞术等方法分析细胞形态学变化和细胞的凋亡。结果显示,PPV感染PK-15细胞可引起细胞存活率下降,促进细胞基因组DNA的片段化和细胞膜磷脂酰丝氨酸外翻,提高Caspase-3的活性,表明PPV体外感染PK-15细胞可诱导细胞的凋亡。上述体内、外实验证实PPV可诱导宿主细胞的凋亡。为探讨PPV诱导细胞凋亡的分子机制,首先需要确定PPV诱导细胞凋亡的相关病毒蛋白。为此本实验利用基因重组技术,通过PCR方法克隆了PPV NS1、VP1和VP2基因并构建了它们的真核表达载体。将不同表达载体,以不同剂量分别转染PK-15细胞使其表达,然后在同一蛋白表达水平下检测PK-15细胞存活率、磷脂酰丝氨酸外翻和Caspase-3活性,比较这3种蛋白对细胞凋亡的影响。结果显示NS1可明显促进细胞膜磷脂酰丝氨酸外翻、提高细胞内Caspase-3的活性和降低细胞的存活率,而VP1和VP2对其没有明显影响。由此证明PPV的NS1蛋白可诱导宿主细胞的凋亡,说明NS1在PPV诱导细胞凋亡中扮演重要角色。为了确定NS1诱导宿主细胞凋亡的途径,将NS1载体转染PK-15细胞,然后通过试剂盒检测细胞Caspase-3、8和9的活性,通过Western blot检测凋亡相关蛋白的表达。结果显示NS1可明显提高Caspase-9和Caspase-3的活化（P<0.05）,而对Caspase-8的活性没有明显影响;NS1可明显促进促凋亡相关蛋白（Bax、p21和p53）的表达,而抑制抗凋亡相关蛋白（Bcl-2和Mcl-1）的表达;同时NS1还明显促进线粒体CytC的释放。然而NS1对细胞凋亡外部途经相关蛋白（如Fas、FasL和TRAIL）的表达没有明显影响。可见NS1是通过内部线粒体途径诱导细胞凋亡的,而不是通过Fas/FasL介导的外部死亡受体途径。为弄清NS1是如何通过线粒体途径诱导细胞凋亡的,将NS1载体转染PK-15细胞,用流式细胞术等技术检测PK-15细胞磷脂酰丝氨酸外翻和线粒体ROS的水平;用荧光素标记/流式细胞仪检测线粒体的损伤;用TMRM荧光素/流式细胞仪检测线粒体的膜电位（ΔΨm）。结果显示NS1可明显提高细胞内ROS的水平（P<0.01）,促进线粒体的损伤和降低线粒体ΔΨm,而ROS抑制剂NAC可明显抑制NS1诱导的细胞凋亡,ROS的产生、线粒体损伤及线粒体ΔΨm的丢失。上述结果表明,NS1诱导细胞凋亡与其介导的ROS的产生导致线粒体损伤有密切关系。为了进一步探讨ROS在NS1诱导细胞凋亡中的作用,用Western blot和流式细胞仪分别检测NS1对细胞DNA的损伤和细胞周期的影响。结果显示,NS1可明显增加γ-H2AX表达,表明NS1可引起细胞DNA的损伤,影响细胞的正常周期,使细胞周期停滞在G1/G2期。ROS抑制剂NAC可部分逆转NS1介导的上述作用,使γ-H2AX表达降低和G1/G2期细胞数量减少。表明ROS在NS1介导细胞DNA损伤和细胞周期停滞中起重要作用。综上所述,本研究在进一步证实PPV感染可诱导细胞凋亡,引起胎盘组织的损伤,导致妊娠母猪流产的基础上,重点探讨PPV诱导细胞凋亡的病毒蛋白及其病毒蛋白诱导细胞凋亡的分子机制。本研究首次发现PPV诱导宿主细胞凋亡与其编码的非结构蛋白1（NS1）密切相关。NS1是通过激活细胞内部线粒体途径诱导宿主细胞凋亡的,ROS在NS1诱导细胞凋亡中起重要作用。本研究为探讨PPV诱导细胞凋亡和组织损伤以及引起妊娠母猪流产的分子机制提供了重要的实验依据。

论文目录

• 摘要
• abstract
• 缩略词
• 1 引言
•   1.1 细胞凋亡的概述
•     1.1.1 细胞凋亡的概念
•     1.1.2 细胞凋亡的相关调控因子
•     1.1.3 细胞凋亡的途径
•     1.1.4 细胞凋亡与细胞坏死
•   1.2 猪细小病毒
•     1.2.1 背景
•     1.2.2 病因学
•     1.2.3 流行病学
•     1.2.4 临床症状和病理变化
•   1.3 猪细小病毒与细胞凋亡
•   1.4 本研究的目的和意义
• 2 PPV体内外感染宿主细胞引起细胞凋亡的研究
•   2.1 材料与方法
•     2.1.1 病毒和细胞
•     2.1.2 病料组织的采集
•     2.1.3 主要试剂和仪器
•     2.1.4 试剂的配制
•     2.1.5 PK-15细胞的培养
•     2.1.6 PPV的扩增
•     2.1.7 组织中PPV、PRV、PRRSV、CSFV和 PCV的检测（RT-PCR或 PCR）
•     2.1.8 琼脂糖凝胶电泳
•     2.1.9 组织石蜡切片制作、HE染色和TUNEL染色
•     2.1.10 细胞存活率的测定
•     2.1.11 细胞凋亡的检测
•     2.1.12 数据统计分析
•   2.2 结果
•     2.2.1 PPV体内感染妊娠母猪引起胎盘组织的损伤
•     2.2.2 PPV感染介导猪胎盘组织的损伤伴随组织的凋亡和坏死
•     2.2.3 PPV体外感染PK-15细胞对细胞形态及细胞存活率的影响
•     2.2.4 PPV体外感染宿主细胞PK-15可诱导细胞凋亡
•   2.3 讨论
•   2.4 小结
• 3 PPV编码蛋白在病毒诱导细胞凋亡中作用的分析
•   3.1 材料与方法
•     3.1.1 病毒、细胞和载体
•     3.1.2 主要试剂和仪器
•     3.1.3 试剂配制
•     3.1.4 PPV DNA的提取
•     3.1.5 猪细小病毒NS1、VP1和VP2 基因的克隆
•     3.1.6 猪细小病毒NS1、VP1和VP2 基因真核表达载体的构建
•     3.1.7 猪细小病毒NS1、VP1和VP2 蛋白的表达与鉴定
•     3.1.8 不同PPV编码蛋白表达水平的检测
•     3.1.9 不同编码蛋白NS1、VP1和VP2 对宿主PK-15 细胞存活率的检测
•     3.1.10 不同编码蛋白NS1、VP1和VP2 对宿主PK-15 细胞凋亡的检测
•     3.1.11 数据统计与分析
•   3.2 结果
•     3.2.1 猪细小病毒NS1、VP1及VP2基因的扩增
•     3.2.2 猪细小病毒NS1、VP1及VP2基因的克隆
•     3.2.3 NS1、VP1及VP2基因在HEK293T细胞中的表达
•     3.2.4 NS1、VP1和VP2 基因在PK-15 细胞中的表达
•     3.2.5 NS1、VP1和VP2 蛋白对细胞存活率的影响
•     3.2.6 NS1、VP1和VP2 蛋白对PK-15 细胞凋亡的影响
•   3.3 讨论
•   3.4 小结
• 4 PPV编码病毒蛋白NS1诱导细胞凋亡机制的研究
•   4.1 材料与方法
•     4.1.1 载体、细胞和病毒
•     4.1.2 主要试剂和仪器
•     4.1.3 主要试剂的配制
•     4.1.4 Caspase活性的检测
•     4.1.5 Western blot检测凋亡相关蛋白因子
•     4.1.6 细胞内ROS的检测
•     4.1.7 线粒体内ROS的检测
•     4.1.8 细胞存活率、Caspase-3 活性及磷脂酰丝氨酸外翻的检测
•     4.1.9 细胞线粒体损伤的检测
•     4.1.10 线粒体膜电位（ΔΨm）的检测
•     4.1.11 Western blot检测γ-H2AX
•     4.1.12 流式细胞仪检测细胞周期
•   4.2 结果
•     4.2.1 NS1 蛋白促进PK-15 细胞内Caspase-9和Caspase-3 的活化
•     4.2.2 NS1 蛋白激活细胞内p53、Bcl-2 家族蛋白介导的内部线粒体途径
•     4.2.3 NS1 蛋白促进细胞内CytC从线粒体释放到细胞浆
•     4.2.4 NS1 不激活细胞内Fas\FasL死亡受体介导的外部凋亡途径
•     4.2.5 NS1可诱导细胞及线粒体内ROS的积累
•     4.2.6 ROS抑制剂对细胞存活率、磷脂酰丝氨酸外翻和Caspase-3 活性的影响
•     4.2.7 NS1诱导细胞线粒体的损伤
•     4.2.8 NS1可诱导线粒体膜电位的丢失
•     4.2.9 NS1可诱导细胞DNA双链的断裂
•     4.2.10 NS1可诱导细胞周期的停滞
•   4.3 讨论
•   4.4 小结
•   4.5 未来研究设想
• 5 结论
• 参考文献
• 在读期间发表的学术论文
• 作者简介
• 致谢

文章来源

类型: 博士论文

作者: 张建楼

导师: 仲飞

关键词: 猪细小病毒,细胞凋亡,线粒体途径

来源: 河北农业大学

年度: 2019

分类: 基础科学,农业科技

专业: 生物学,畜牧与动物医学

单位: 河北农业大学

分类号: S852.65

DOI: 10.27109/d.cnki.ghbnu.2019.000424

总页数: 97

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