犬瘟热病毒P蛋白单克隆抗体的制备及其抗原表位的筛选

论文摘要

犬瘟热（Canine distemper）是由犬瘟热病毒（Canine distemper virus,CDV）感染引起多种动物共患、多系统感染的高度接触性传染病。为获得CDV野毒株（CDV-PS）截短磷蛋白（aa 232-507）,本实验以Asia-1型CDV-PS毒株为基础,经PCR扩增得到P（aa 232-507）基因,连接到原核表达载体pEASY○R-Blunt E1中,构建重组原核表达载体E1-CDV-P。将重组质粒转化到BL21感受态细胞中进行原核表达并对诱导条件进行优化。超声破碎最佳条件下的诱导产物,经离心后对重组蛋白进行可溶性分析,随后用Ni-NTA亲和层析对重组截短P蛋白进行纯化并用SDS-PAGE和Western blot进行鉴定。结果显示:重组P蛋白大小约37 kDa,在IPTG终浓度0.1 mmol/L,诱导时间为8 h时,表达量最高;重组P蛋白以包涵体形式存在,经SDS-PAGE和Western blot鉴定,成功纯化出重组截短P蛋白;重组P蛋白具有良好的免疫反应性。本研究成功制备出CDV-PS毒株截短P蛋白,为进一步P蛋白抗原表位的研究和CDV抗体诊断方法的研发奠定基础。为获得抗P（aa 232-507）蛋白的单克隆抗体,本研究用纯化的P（aa 232-507）蛋白免疫BALB/c小鼠。利用细胞融合技术和间接ELISA抗体筛选方法,制备了4株抗CDV-PS毒株P（aa233-507）的单抗,分别命名为Pc7,Pc8,Pc11和Pc25。Western blot和IFA鉴定其均能与CDV-PS毒株的P蛋白（aa232-507）特异性反应。但单抗Pc8不特异性识别CDV3疫苗株,说明单抗Pc8所识别的抗原表位在CDV-PS毒株和CDV3疫苗株之间存在着关键性位点的突变。单抗Pc25不特异性识别CDV-Rockborn疫苗株,说明单抗Pc25的抗原表位在CDV-PS毒株和CDV-Rockborn疫苗株之间也存在着关键性位点的突变。本研究成功制备出的抗CDV-PS毒株P（aa 232-507）蛋白单克隆抗体,为进一步筛选4株单抗的线性抗原表位奠定基础。为鉴定4株单抗的线性抗原表位,本研究通过肽扫描技术利用间接ELISA方法鉴定Pc7,Pc8,Pc11和Pc25的抗原表位。结果显示单抗Pc7识别的抗原表位是238SHGMGIVAGSTN249,单抗Pc8识别的抗原表位是264GPSVSAENVRQ274,单抗Pc11识别的抗原表位是390INPELRPIIGR400,单抗Pc25识别的抗原表位是252TQSALKSTG260。抗原表位比对分析结果显示,单抗Pc7的抗原表位在多个不同毒株中均有突变;单抗Pc25的抗原表位在Asia-1型（除CDV-ZC;140816外）、America-1型、Europe型毒株的相应抗原表位区域没有突变点,而在Asia-2型和大部分America-2型毒株中均有突变;单抗Pc8的抗原表位在多个毒株中均有突变;单抗PC11所识别的线性B细胞表位在不同的CDV毒株中高度保守。本研究成功筛选了4株单抗所识别的线性抗原表位,为建立CDV的诊断方法奠定了基础。

论文目录

• 摘要
• abstract
• 第一章 引言
•   1.1 犬瘟热病毒的概述
•   1.2 犬瘟热病毒分子生物学研究进展
•     1.2.1 CDV的形态及理化性质
•     1.2.2 CDV基因编码的蛋白
•     1.2.3 CDV受体
•   1.3 犬瘟热病毒诊断方法的研究进展
•     1.3.1 CDV的血清学检测方法
•     1.3.2 CDV的分子生物学检测方法
•   1.4 抗原表位鉴定方法的研究进展
•     1.4.1 合成多肽技术
•     1.4.2 氨基酸定点突变技术
•     1.4.3 噬菌体展示技术
•     1.4.4 肽扫描技术
•     1.4.5 生物信息学方法预测技术
•     1.4.6 多肽芯片技术
•     1.4.7 流式细胞仪检测技术
•     1.4.8 免疫亲和质谱技术
•   1.5 本研究的目的与意义
• 第二章 犬瘟热病毒截短P蛋白的原核表达及纯化
•   2.1 材料与方法
•     2.1.1 主要试剂与仪器
•     2.1.2 毒株
•     2.1.3 引物设计与合成
•     2.1.4 样品总RNA的提取及反转录
•     2.1.5 CDV目的基因的扩增测序
•     2.1.6 pEASY○R-Blunt E1-CDV-P原核表达载体的构建
•     2.1.7 重组截短P蛋白（简称重组P蛋白）的表达
•     2.1.8 重组P蛋白表达的Western blot验证
•     2.1.9 重组P蛋白诱导条件的优化
•     2.1.10 重组P蛋白的可溶性分析及纯化
•     2.1.11 重组P蛋白的免疫反应性实验
•   2.2 结果
•     2.2.1 P232-507基因PCR扩增产物的鉴定
•     2.2.2 重组质粒pEASY○R-Blunt E1-CDV-P的鉴定
•     2.2.3 重组P蛋白的表达验证
•     2.2.4 重组P蛋白诱导条件的筛选和鉴定
•     2.2.5 重组P蛋白的可溶性鉴定及纯化结果
•     2.2.6 重组P蛋白的免疫反应性结果
•   2.3 讨论
•   2.4 小结
• 第三章 犬瘟热病毒P蛋白单克隆抗体的制备
•   3.1 材料
•     3.1.1 种毒、细胞系与实验动物
•     3.1.2 主要试剂和耗材
•     3.1.3 动物免疫程序
•     3.1.4 间接ELISA检测血清效价
•     3.1.5 细胞融合试验
•     3.1.6 阳性杂交瘤细胞的筛选
•     3.1.7 杂交瘤细胞腹水的制备
•     3.1.8 单克隆抗体特性鉴定
•   3.2 结果
•     3.2.1 间接ELISA检测的结果
•     3.2.2 阳性杂交瘤细胞的筛选结果
•     3.2.3 重组P蛋白与单克隆抗体的Western blot分析
•     3.2.4 CDV与单克隆抗体的Western blot分析
•     3.2.5 CDV与单克隆抗体的间接免疫荧光试验分析
•   3.3 讨论
•   3.4 小结
• 第四章 犬瘟热病毒P蛋白单克隆抗体线性表位的筛选
•   4.1 材料与方法
•     4.1.1 试剂与仪器
•     4.1.2 多肽的制备与保存
•     4.1.3 ELISA鉴定多肽与单克隆抗体的结合力
•     4.1.4 抗原表位的筛选
•     4.1.5 CDV阳性血清鉴定最短线性抗原表位
•     4.1.6 抗原表位比对分析
•   4.2 结果
•     4.2.1 ELISA鉴定结果
•     4.2.2 抗原表位的筛选
•     4.2.3 CDV阳性血清鉴定结果
•     4.2.4 抗原表位的比对分析结果
•   4.3 讨论
•   4.4 小结
• 第五章 全文结论
• 参考文献
• 附录
• 致谢
• 作者简介

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 李爽

导师: 程世鹏

关键词: 犬瘟热病毒,蛋白,单克隆抗体,抗原表位

来源: 中国农业科学院

年度: 2019

分类: 基础科学,农业科技

专业: 生物学,畜牧与动物医学

单位: 中国农业科学院

分类号: S852.65

总页数: 60

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