猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5蛋白中和性抗原表位的噬菌体展示及其抗原性研究

论文摘要

猪繁殖与呼吸综合征（Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome PRRS）是由猪繁殖与呼吸病毒（Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus PRRSV）引起的一种高度传染性疾病。该病主要是以预防为主,疫苗接种是预防该病的首要措施。GP5蛋白是PRRSV重要的结构蛋白,存在六个重要的抗原决定簇,可以诱导中和抗体的产生,一直是疫苗研发的重要靶蛋白。中和性B细胞表位已经被确认为该病毒的中和性抗原区域。本研究旨在探究中和性B细胞表位诱导机体产生中和抗体及其作用。首先以合成中和性B细胞表位对7个猪场经不同商品化疫苗免疫的430份猪免疫临床血清进行检测,检测表明不同猪场的血清抗体水平阳性百分比在86.11%98.15%之间。以中和性B细胞表位为目的展示序列,分别与靶向肽DC3pep、非靶向肽SCRMpep进行融合,通过噬菌体展示技术构建重组噬菌体M13-DC3pep-GP5-B和M13-SCRMpep-GP5-B,以临床PRRSV阳性血清进行western blot分析二者的免疫反应原性。以1.0×1013pfu/mL的重组噬菌体M13-DC3pep-GP5-B、M13-DC3pep-GP5-B混合弗氏佐剂和M13-SCRMpep-GP5-B免疫小鼠,对小鼠血清进行特异性抗体检测,表明重组噬菌体M13-DC3pep-GP5-B和M13-SCRMpep-GP5-B均具有良好的反应原性;M13-DC3pep-GP5-B混合弗氏佐剂免疫组的小鼠血清有特异性抗体产生,抗体水平在第四周达到最高为0.94;免疫组M13-DC3pep-GP5-B小鼠抗体水平在第六周达到最高为0.93,免疫组M13-SCRMpep-GP5-B的抗体水平在第六周达到最高为0.634,免疫组M13-DC3pep-GP5-B的特异性抗体水平均高于免疫组M13-SCRMpep-GP5-B,二者差异显著（p<0.05）。将重组噬菌体M13-DC3pep-GP5-B、M13-DC3pep-GP5-B混合氢氧化铝佐剂和M13-SCRMpep-GP5-B以1.0×1013pfu/mL的剂量免疫断奶仔猪,对仔猪血清进行特异性抗体检测,以临床分离PRRSV毒株对仔猪血清进行中和试验,表明M13-DC3pep-GP5-B混合氢氧化铝佐剂免疫组的抗体水平在末次免疫后第四周达到最高为0.687,且其抗体水平显著高于免疫M13-DC3pep-GP5-B组和M13-SCRMpep-GP5-B组（p<0.05）;免疫组M13-DC3pep-GP5-B的特异性抗体水平高于免疫组M13-SCRMpep-GP5-B,无显著差异（P>0.05）;但是诱导机体产生的中和抗体水平较低,免疫血清只在低稀释度时对PRRSV呈现中和活性。为了进一步发现并验证猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒（PRRSV）保护性抗原GP5蛋白羧基端新的中和性表位,本研究运用生物信息学软件预测PRRSV GP5蛋白羧基端的抗原性,全基因合成GP5蛋白羧基端168-198位氨基酸的编码序列,构建了重组噬菌体M13-GP5168-198aa,以临床PRRSV阳性血清进行western blot分析重组噬菌体表面展示的GP5 168-198aa多肽的免疫反应原性。以1.0×1013pfu/mL重组噬菌体混合氢氧化铝佐剂制备的免疫抗原,按照灭活疫苗免疫程序肌肉注射免疫PRRSV抗体阴性断乳仔猪,以临床分离PRRSV毒株进行中和试验。结果显示:以临床阳性血清进行Western blot分析表明重组噬菌体表面展示的GP5168-198aa多肽具有免疫反应原性;免疫仔猪诱导仔猪产生的中和性抗体在第六周达到最高,中和滴度为1:10.08。综上,人工合成PRRSV GP5蛋白的中和性B细胞表位可用于临床猪血清PRRSV抗体的检测;运用噬菌体展示技术展示了中和性B细胞表位,免疫断奶仔猪,诱导机体产生的中和抗体水平较低,免疫血清只在低稀释度时对PRRSV呈现中和活性;生物学软件预测GP5蛋白羧基端的抗原表位进行展示,免疫断奶仔猪,可以诱导仔猪产生中和性抗体,仔猪免疫血清在细胞水平上对PRRSV呈现良好的中和作用。为PRRSV GP5新型多表位疫苗的开发奠定了基础。

论文目录

• 中文摘要
• abstract
• 英文缩写词
• 前言
• 第一篇 文献综述
•   第一章 猪繁殖与呼吸综合征（PRRS）及靶向肽的研究与进展
•     1.1 猪繁殖与呼吸综合征（PRRS）的发生与危害
•     1.2 PRRSV的基因结构
•     1.3 PRRSV的主要病毒蛋白及其功能
•     1.4 PRRSV的生物学特征
•     1.5 PRRSV诱导的免疫应答
•     1.6 PRRS疫苗研究现状
•     1.7 树突状细胞概述
•     1.8 靶向肽的研究进展及应用
•   第二章 噬菌体展示技术的研究概述
•     2.1 噬菌体展示技术的历史及基本原理
•     2.2 噬菌体展示系统的类型
•     2.3 噬菌体展示系统的应用
• 第二篇 研究内容
•   第一章 基于PRRSV GP5 蛋白中和性B细胞表位的ELISA法对临床猪免疫血清的检测
•     1.1 材料
•     1.2 方法
•     1.3 结果
•     1.4 讨论
•     1.5 小结
•   第二章 PRRSV GP5 蛋白中和性B细胞表位的噬菌体展示及其抗原性研究
•     2.1 材料
•     2.2 方法
•     2.3 结果
•     2.4 讨论
•     2.5 小结
•   第三章 PRRSV GP5 蛋白羧基端的噬菌体展示及其抗原性研究
•     3.1 材料
•     3.2 方法
•     3.3 结果
•     3.4 讨论
•     3.5 小结
• 结论
• 参考文献
• 导师简介
• 作者简介
• 攻读硕士期间发表的学术论文及其他成果
• 致谢

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 王艳梅

导师: 韩文瑜

关键词: 猪繁殖与呼吸综合征病毒,噬菌体展示,中和抗体

来源: 吉林大学

年度: 2019

分类: 基础科学,农业科技

专业: 生物学,畜牧与动物医学

单位: 吉林大学

基金: 国家自然基金(No.31572553,31872505和31502103),十三五国家重点研发项目(No.2017YFD0501000)

分类号: S852.65

总页数: 78

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