桂花ERF2转录因子在CCD1和CCD4基因表达调控中的作用研究

论文摘要

桂花（Osmanthus fragrans Lour）又名木犀、岩桂和九里香,是木犀科木犀属植物,原产我国,是特有的常绿阔叶灌木或小乔木经济树种,具有2500多年的栽培历史,是我国十大传统名花之一。桂花因具有丰富的颜色和独特的芳香,从古至今备受人们喜爱,而且在观赏、食品、药用和香料等方面具有广泛的应用价值。根据开花时期、花色花香等特征,桂花可以分为银桂品种群、四季桂品种群、金桂品种群、丹桂品种群和彩叶桂品种群。研究发现,桂花花瓣的颜色是由类胡萝卜素含量决定的,花瓣中类胡萝卜素的含量越高,花瓣的颜色越深。桂花花瓣类胡萝卜素裂解双加氧酶（carotenoid cleavage dioxygenase,CCD）CCD1和CCD4可以裂解类胡萝卜素产生芳香物质紫罗兰酮（包括α-紫罗兰酮和β-紫罗兰酮）,使桂花具有独特的香味。因此,CCD1和CCD4是桂花类胡萝卜素裂解和紫罗兰酮产生的关键基因。本研究利用分子生物学方法研究桂花ERF2转录因子对桂花CCD1和CCD4基因表达的调控,主要研究结果如下:（1）桂花ERF2基因克隆及CCD1、CCD4和ERF2基因的表达模式分析设计特异性引物扩增ERF2基因,该基因编码区全长732 bp,编码244个氨基酸。Blast比对显示,ERF2含有1个AP2结构域,与油橄榄（Olea europaea）、芝麻（Sesamum indicum）和烟草（Nicotiana tabacum）的ERF2氨基酸序列具有较高的同源性,桂花ERF2蛋白与油橄榄（Olea europaea）具有较近的亲缘关系。RT-PCR结果显示,不同花期银桂和丹桂花瓣中CCD1、CCD4与ERF2基因表达模式基本一致,推测ERF2转录因子可能参与了CCD1和CCD4基因表达的调控。（2）ERF2转录因子亚细胞定位构建35S::ERF2重组表达载体,以35S::GFP载体作为对照,利用农杆菌介导的瞬时转化技术转入烟草,25℃培养3天后,荧光显微镜下观察。发现对照叶片细胞中绿色荧光主要集中在细胞质中,而ERF2超表达的叶片细胞中绿色荧光集中在细胞核中,表明ERF2转录因子定位在细胞核中。（3）桂花ERF2基因在烟草叶片中超表达促进了烟草CCD1和CCD4基因的表达利用农杆菌瞬时转化法将35S::ERF2和35S::GFP载体分别转化入烟草,于25℃培养3天后,提取叶片中的RNA,利用荧光定量PCR检测CCD1和CCD4基因的表达量。结果表明,ERF2基因超表达促进了CCD1和CCD4基因的表达。（4）桂花ERF2转录因子与CCD1和CCD4基因启动子相关元件的相互作用分析将35S::ERF2超表达载体分别与CCD1pro::GUS和CCD4pro::GUS重组载体通过农杆菌瞬时转化转入烟草,以35S::GFP/CCD1pro::GUS和35S::GFP/CCD4pro::GUS载体组合作为对照。25℃培养3天后,利用组织化学染色法和荧光定量PCR对烟草叶片中GUS蛋白活性与GUS基因的表达量进行检测,结果显示,对照叶片分别显示微弱蓝色,而ERF2超表达的烟草叶片分别显示较深蓝色,而且ERF2超表达的烟草叶片中GUS基因的表达量显著高于对照组。说明ERF2转录因子可以与CCD1和CCD4基因启动子相关元件结合,从而使GUS基因表达上调。（5）OfERF2蛋白的原核表达与纯化构建pET-30a-ERF2原核蛋白表达载体,转入BL21感受态细胞,经IPTG诱导表达后,通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测发现35KD大小的ERF2目的蛋白条带,并纯化了ERF2蛋白。（6）凝胶迁移阻滞实验（EMSA）验证ERF2蛋白与CCD1和CCD4基因启动子上相关元件的相互作用体外合成含有CCD1和CCD4基因启动子上的ERF转录因子结合元件的探针,利用EMSA实验验证ERF2蛋白与相关元件相互作用。结果表明,同时加入ERF2蛋白和荧光标记的元件电泳时,出现了明显的滞留条带,说明ERF2蛋白可以和CCD1和CCD4基因启动子上的ERF转录因子结合元件在体外结合。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 绪论
•   1.1 桂花的研究背景
•   1.2 桂花花色与花香研究进展
•   1.3 类胡萝卜素裂解双加氧酶CCD基因研究进展
•   1.4 转录因子的简介及相关研究技术
•     1.4.1 转录因子简介
•     1.4.2 AP2/ERF转录因子简介
•     1.4.3 ERF转录因子的结构
•     1.4.4 ERF转录因子作用机制
•     1.4.5 ERF转录因子的功能
•   1.5 烟草瞬时转化技术
•   1.6 EMSA技术
•   1.7 本研究的目的与意义
• 第二章 桂花ERF2 基因的克隆及ERF2与CCD1和CCD4 基因的表达模式分析
•   2.1 实验材料
•     2.1.1 植物材料
•     2.1.2 实验仪器与试剂
•     2.1.3 实验所需引物
•   2.2 实验方法
•     2.2.1 桂花花瓣RNA的提取
•     2.2.2 RNA琼脂糖凝胶电泳检测
•     2.2.3 RNA反转录
•     2.2.4 桂花ERF2 基因的扩增
•     2.2.5 目的片段的回收纯化
•     2.2.6 桂花ERF2 基因与CCD1和CCD4 基因表达模式分析
•   2.3 结果与分析
•     2.3.1 ERF2 转录因子的序列分析
•     2.3.2 不同花期银桂和丹桂花瓣CCD1、CCD4和ERF2 基因表达量分析
•   2.4 讨论
• 第三章 Of ERF2 转录因子亚细胞定位
•   3.1 实验材料
•     3.1.1 植物材料
•     3.1.2 质粒载体与菌株
•     3.1.3 实验仪器与药品试剂
•   3.2 实验方法
•     3.2.1 目的片段的扩增与回收
•     3.2.2 35 S::OfERF2 超表达载体的构建
•     3.2.3 35 S::OfERF2 超表达重组载体的检测、提取
•     3.2.4 农杆菌感受态细胞的制备与转化
•     3.2.5 烟草转化与亚细胞定位分析
•   3.3 结果与分析
•     3.3.1 35 S::OfERF2 重组载体的构建
•     3.3.2 转化烟草的亚细胞定位分析
•   3.4 讨论
• 第四章 桂花ERF2 基因在烟草叶片中超表达分析
•   4.1 实验材料
•     4.1.1 植物材料
•     4.1.2 质粒载体和菌株
•     4.1.3 实验仪器与试剂药品
•   4.2 实验方法
•     4.2.1 目的基因的获得
•     4.2.2 35 S::OfERF2 超表达重组载体的构建
•     4.2.3 35 S::OfERF2 超表达重组载体的检测和提取
•     4.2.4 制备农杆菌感受态细胞与转化
•     4.2.5 烟草叶片的转化
•     4.2.6 烟草叶片的超表达检测
•   4.3 结果分析
•   4.4 讨论
• 第五章 桂花ERF2 转录因子与CCD1和CCD4 基因启动子相互作用分析
•   5.1 实验材料
•     5.1.1 植物材料
•     5.1.2 质粒载体与菌株
•     5.1.3 实验试剂与仪器
•     5.1.4 实验所用引物序列
•   5.2 实验方法
•     5.2.1 桂花花瓣DNA的提取
•     5.2.2 目的基因的扩增、纯化和酶切
•     5.2.3 CCD1pro::GUS和 CCD4pro::GUS重组质粒的构建
•     5.2.4 CCD1pro::GUS和 CCD4pro::GUS靶质粒的鉴定与提取
•     5.2.5 农杆菌感受态细胞的制备与转化
•     5.2.6 35 S::OfERF2 超表达载体与CCD1pro::GUS和 CCD4pro::GUS靶质粒共转化
•     5.2.7 烟草GUS染色
•     5.2.8 共转化烟草叶片中GUS基因表达量检测
•   5.3 结果与分析
•     5.3.1 CCD1pro::GUS和 CCD4pro::GUS重组载体的构建
•     5.3.2 35 S::OfERF2 超表达载体与CCD1pro::GUS和 CCD4pro::GUS靶质粒共转化以及GUS染色
•     5.3.3 共转化烟草叶片中GUS基因表达量的检测
•   5.4 讨论
• 第六章 Of ERF2 蛋白与CCD1和CCD4 基因启动子上相关元件的相互作用
•   6.1 实验材料
•     6.1.1 质粒载体与菌株
•     6.1.2 实验仪器与试剂
•     6.1.3 溶液配制
•   6.2 实验方法
•     6.2.1 ERF2 基因的扩增与纯化
•     6.2.2 载体和目的片段酶切与连接
•     6.2.3 重组质粒的转化与检测
•     6.2.4 诱导目的蛋白的表达与检测
•     6.2.5 目的蛋白的纯化
•     6.2.6 EMSA 实验
•   6.3 结果与分析
•     6.3.1 目的蛋白的诱导表达与纯化
•     6.3.2 EMSA 验证实验
•   6.4 讨论
• 第七章 结论
• 参考文献
• 致谢

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 王红运

导师: 尚富德,韩远记

关键词: 桂花,转录因子,重组载体,启动子

来源: 河南大学

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学,生物学

单位: 河南大学

基金: 国家自然科学基金

分类号: Q943.2

总页数: 64

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