银星竹鼠卵巢发育及相关基因表达调控的研究

论文摘要

地下鼠由于常年地下生活,进化出了一系列区别于地面鼠的适应性特征,典型特征是繁殖力下降。动物繁殖对维护种群稳定和物种多样性有重要意义。银星竹鼠（Rhizomys pruinosus）作为一种地下鼠,繁殖力较低,平均胎仔数仅2-4只,是研究地下鼠繁殖调控的理想物种。对卵巢发育规律的研究可为探究银星竹鼠繁殖调控提供理论基础。通过初步探究几个关键时期银星竹鼠卵巢的发育,识别与卵巢发育相关基因和转录组遗传信息,为银星竹鼠及地下鼠的繁殖研究提供基础资料,同时也为探究地下鼠卵巢发育与繁殖力下降的关系奠定理论基础。本研究采用解剖学方法对不同年龄组（两周龄组、一月龄组、三月龄组、性成熟组和怀孕组）银星竹鼠卵巢发育作了研究,同时做转录组测序。在测序结果中筛选差异表达基因（differentially expressed gene,DEG）并对其进行Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes（KEGG）数据库富集,得到显著性最大的两条通路:卵巢类固醇合成通路和肾素血管紧张素系统通路。随后对这两条通路上的差异表达基因进行实时定量PCR（q-PCR）验证。旨在初步揭示银星竹鼠卵巢发育规律。研究主要结果如下:1.利用石蜡切片技术对不同时期银星竹鼠卵巢结构及卵泡构成研究,结果显示两周龄银星竹鼠卵巢只有原始卵泡;一月龄和三月龄卵巢中出现初级卵泡和次级卵泡;性成熟和孕期竹鼠卵巢仅有少量窦腔卵泡和成熟卵泡;孕期竹鼠卵巢中平均仅有2-3个黄体。表明银星竹鼠卵巢发育较晚,两周龄还未进入卵泡生长阶段,进入育龄期较晚;单次排卵数少,仅为2-3个,胎仔数少,繁殖力较低。2.对银星竹鼠五个时期卵巢转录组数据分析,两周龄vs一月龄筛选出3339个DEGs（差异表达基因）,其中2240个上调,1099个下调;一月龄vs三月龄筛选出1820个DEGs,906个上调,914个下调;三月龄vs性成熟期筛选出1470个DEGs,800个上调,670个下调;性成熟vs孕期筛选出63个DEGs,55个上调,8个下调。识别到的大量与卵巢发育相关的基因,为研究银星竹鼠卵巢发育和繁殖奠定了理论基础。所有DEGs在KEGG数据库比对后,卵巢类固醇合成通路和肾素血管紧张素系统（RAS）被极显著富集到。其中第一条通路在不同DEGs集里都被显著富集到（除性成熟vs孕期）,第二条通路仅在性成熟vs孕期中被富集到。结果说明银星竹鼠卵巢发育既受到类固醇合成通路又受到RAS调控。其中银星竹鼠卵巢整个发育过程中都显著受到类固醇合成通路的调控,而肾素血管紧张素系统可能主要在孕期发挥调控作用。识别到的大量与卵巢发育相关的基因为研究银星竹鼠卵巢发育及地下鼠繁殖调控奠定了理论基础。3.对卵巢类固醇合成通路中DEGs进行q-PCR验证。结果表明:与两周龄相比,17α-羟孕酮去乙酰化酶(Cyp17在一月龄,三月龄,性成熟期均极显著上调。与两周龄相比,胆固醇侧链裂解酶（Cyplla）,雌二醇17β脱氢酶（17β-hsd）和3β-羟类固醇脱氢酶（3ββ-hsd）在三月龄和性成熟期均极显著上调,但与一月龄无差异。对肾素血管紧张素系统中DEGs进行q-PCR验证。结果表明:与性成熟相比,血管紧张素转换酶（Ace）,血管紧张素原(AgO,血管紧张素Ⅱ受体2（AgtⅡr2）,肥大细胞羧肽酶（Cpa3）和肥大细胞类糜蛋白酶（Gnd）在孕期均不同程度上调。所有基因表达趋势均与转录组结果趋势一致。这些结果显示类固醇合成通路在卵巢整个发育过程中起到明显的调控作用,RAS系统对排卵后期卵巢的调控比较明显。卵巢类固醇合成通路和肾素血管紧张素系统共同作用于卵巢,调节卵巢发育及发挥功能。总之,本研究通过形态学观察,转录组测序及q-PCR验证,发现银星竹鼠发育较晚,两周龄还未进入卵泡生长阶段。银星竹鼠可能通过延缓卵巢发育,推迟进入育龄期时间而减缓种群增长,保持种群稳定。同时也可能通过主动减少排卵数而降低胎仔数,进而适应地下容纳量较低的环境。此外,本研究识别的大量与卵巢发育相关的基因也为研究银星竹鼠和地下鼠卵巢发育与繁殖力降低的关系奠定了理论基础。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第1章 引言
•   1.1 地下鼠
•   1.2 银星竹鼠生物学特征
•   1.3 哺乳动物卵巢结构与功能
•     1.3.1 哺乳动物卵巢的结构
•     1.3.2 卵巢的排卵功能
•     1.3.3 卵泡的分类
•     1.3.4 卵巢的内分泌功能
•   1.4 卵巢发育两种调控途径
•     1.4.1 卵巢类固醇合成通路
•     1.4.2 肾素血管紧张素系统
•   1.5 测序技术的发展历史
•     1.5.1 转录组概述
•     1.5.2 转录组测序的重要步骤及流程
•   1.6 研究目的与意义
• 第2章 银星竹鼠卵巢发育
•   2.1 研究材料
•     2.1.1 研究动物
•     2.1.2 研究设备及耗材
•     2.1.3 实验材料及试剂
•   2.2 研究方法
•     2.2.1 动物组织的提取
•     2.2.2 石蜡切片的制作
•     2.2.3 HE染色
•     2.2.4 卵泡大小及数量的测量
•   2.3 结果与分析
•     2.3.1 不同时期卵巢组织组织学特征
•     2.3.2 卵泡计数
•     2.3.3 各级卵泡大小测量
•   2.4 讨论
• 第3章 银星竹鼠卵巢转录测序
•   3.1 研究材料
•     3.1.1 研究动物
•     3.1.2 研究设备及耗材
•     3.1.3 实验试剂
•   3.2 研究方法
•     3.2.1 总RNA提取
•     3.2.2 总RNA质量检测
•     3.2.3 cDNA文库构建
•     3.2.4 转录组质控与测序
•     3.2.5 Unigene功能注释及表达量分析
•     3.2.6 基因结构分析
•     3.2.7 差异表达基因筛选
•     3.2.8 差异表达基因功能注释和富集分析
•   3.3 结果与分析
•     3.3.1 总RNA提取结果
•     3.3.2 转录组测序与组装结果
•     3.3.3 Unigene功能注释
•     3.3.4 基因结构分析
•     3.3.5 基因表达量分析
•     3.3.6 差异表达基因识别
•     3.3.7 差异表达基因功能注释分析
•     3.3.8 差异表达基因GO功能富集分析
•     3.3.9 差异表达基因KEGG通路注释
•   3.4 讨论
• 第4章 卵巢类固醇合成相关基因表达的q-PCR验证
•   4.1 研究材料
•     4.1.1 研究动物
•     4.1.2 研究设备及耗材
•     4.1.3 实验试剂
•   4.2 研究方法
•     4.2.1 cDNA合成
•     4.2.2 引物设计
•     4.2.3 模板及引物专一性检测
•     4.2.4 实时定量PCR验证
•     4.2.5 数据分析
•   4.3 结果及分析
•     4.3.1 模板及引物专一性检测
•     4.3.2 类固醇合成相关基因实时定量结果
•     4.3.3 Cyplla mRNA的表达
•     4.3.4 Cyp17 mRNA的表达
•     4.3.5 17β-hsd mRNA的表达
•     4.3.6 3β3-hsd mRNA的表达
•   4.4 讨论
• 第5章 肾素血管紧张素系统相关基因表达的q-PCR验证
•   5.1 材料与方法
•   5.2 结果及分析
•     5.2.1 模板及引物专一性检测
•     5.2.2 肾素血管紧张素系统相关基因实时定量结果
•     5.2.3 Ace mRNA的表达
•     5.2.4 Cpa3 mRNA的表达
•     5.2.5 Cmal mRNA的表达
•     5.2.6 Agt mRNA的表达
•     5.2.7 AgtIIr2 mRNA的表达
•   5.3 讨论
• 第6章 总结及展望
• 参考文献
• 附录
• 致谢
• 攻读硕士学位期间研究成果

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 徐璐璐

导师: 李金钢

关键词: 银星竹鼠,地下鼠,转录组,卵巢发育,繁殖

来源: 陕西师范大学

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学,生物学

单位: 陕西师范大学

分类号: Q953

DOI: 10.27292/d.cnki.gsxfu.2019.000974

总页数: 89

文件大小: 8534K

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