导读:本文包含了天冬氨酸脱羧酶论文开题报告文献综述、选题提纲参考文献及外文文献翻译，主要关键词:脱羧酶,天冬,氨酸,丙氨酸,热稳定性,突变,细胞。
天冬氨酸脱羧酶论文文献综述
叶文琪,薛岚,王超,崔文璟,周哲敏[1]（2019）在《昆虫来源L-天冬氨酸-α-脱羧酶突变体的酶学性质表征》一文中研究指出选取突变体K49R进行分离纯化、酶学性质表征,并进行全细胞催化合成β-丙氨酸,旨在研究红粉甲虫来源的L-天冬氨酸-α-脱羧酶(L-aspartate-α-decarboxylase,ADC)的酶学性质,并为生物法制备β-丙氨酸提供理论与技术支持。突变体K49R最适pH为6. 5,在pH 6. 0～7. 0之间保持稳定;最适温度为42℃,热稳定性较野生型提高1. 7倍;底物亲和力大幅提高,催化效率是野生型的1. 8倍。在培养基中添加10 g/L葡萄糖可以有效提高重组菌的生物量,以及重组酶的可溶性表达量;在全细胞催化合成β-丙氨酸体系中,添加磷酸吡哆醛(pyridoxal-5-phosphate,PLP)可以缩短反应时间,提高催化效率。该研究开发了具有工业化潜力的工程菌,建立了绿色、高效的β-丙氨酸生物合成法,为β-丙氨酸生物合成的产业化奠定了重要基础。(本文来源于《食品与发酵工业》期刊2019年19期）
莫芹,李由然,石贵阳[2]（2019）在《磷酸吡哆醛依赖型天冬氨酸α-脱羧酶的研究》一文中研究指出丙氨酸作为一种重要的平台化合物,是合成含氮化合物的前体。相较于化学合成法,人们更倾向于利用L-天冬氨酸-α脱羧酶(ADC)环保地制备β-丙氨酸。由于细菌来源的ADC存在严重的机理性底物失活,限制了其在工业上的应用。实验在大肠杆菌中表达了3种古细菌来源的ADC,纯化和测定了其对于L-天冬氨酸的脱羧活性。考察了来源于詹氏甲烷球菌的重组酶(ADC_(M.j))的酶学性质和辅酶磷酸吡哆醛的稳定性,进行了酶转化实验。重组酶ADC_(M.j)的比酶活为6.87U/mg,最适温度和pH分别为80℃和8.0,具有很强的热稳定性,适合用于工业生产。这类磷酸吡哆醛依赖型ADC,酶催化中没有基于机理的底物失活作用,但其辅酶的稳定性和循环利用是其酶催化中的主要限制因素。(本文来源于《发酵科技通讯》期刊2019年02期）
莫芹[3]（2019）在《L-天冬氨酸α-脱羧酶催化失活相关分子机制的研究》一文中研究指出氨基酸脱羧酶(Amino acid decarboxylase)是一类催化氨基酸脱去羧基生成小分子氨基酸或者生物胺的裂解酶的总称,其产物在生物体内大多具有特殊的生理作用。其中L-天冬氨酸α-脱羧酶(L-aspartate alpha-decarboxylase,EC:4.1.1.11,PanD/ADC)因其能够催化L-天冬氨酸脱去α-羧基生成β-丙氨酸而成为最受关注的氨基酸脱羧酶之一。β-丙氨酸作为重要的平台化合物,是合成泛酸钙、肌肽、1,4-丁二胺、丙烯酰胺等大宗化学品的前体,在生物制药、食品、化工等领域均有广泛的应用,具有巨大的工业价值。当前利用L-天冬氨酸α-脱羧酶和廉价原料L-天冬氨酸绿色制造β-丙氨酸已逐步成为取代传统化学法的主流工艺。然而,已实现工业化应用的L-天冬氨酸α-脱羧酶仅来源于大肠杆菌、谷氨酸棒杆菌或枯草芽孢杆菌,生产效率极为低下,因为它们在催化过程中均表现出不可逆的失活现象(简称催化失活),而目前该不可逆失活的机制尚没有被清晰解释,是相关生物产业发展的严重桎梏。本论文通过构建L-天冬氨酸α-脱羧酶的假定蛋白文库,获得了大量不同来源的L-天冬氨酸α-脱羧酶资源,考察了该酶的催化失活规律。通过动力学分析,解析这一类酶催化失活的机制,并且建立了催化失活强度的表征方法;最后,从自剪切加工和催化结构域两个方面鉴定催化失活相关的结构基础。主要研究结果如下:(1)通过构建假定蛋白文库,筛选获得了53种不同来源的L-天冬氨酸α-脱羧酶基因。通过对GenBank生物信息数据库中L-天冬氨酸α-脱羧酶编码基因的查找和系统进化分析,建立了假定蛋白文库,实现了其中38种重组酶在大肠杆菌系统中的表达与纯化,进一步的酶活力测定结果表明其中33种重组酶具有L-天冬氨酸α-脱羧酶活性。通过分析文库中重组酶催化失活情况,发现丙酮酰依赖型L-天冬氨酸α-脱羧酶(PYR-ADC)存在普遍的催化失活作用,然而磷酸吡哆醛依赖型L-天冬氨酸α-脱羧酶(PLP-ADC)没有表现出催化失活作用。另外,通过对酶活力的调查结果显示,目前现有的工业酶是低效的,文库挖掘获得了8个催化效率更高的酶,其中来源于Corynebacterium jeikeium的PD_(Cjei)比酶活达到11.55 U/mg,为目前报道最高。(2)通过催化失活动力学分析,发现了PYR-ADC催化失活的不可逆性,并且建立了催化失活强度的表征方法。通过对重组酶剩余酶活与反应时间/底物浓度关系的测定,发现该酶的失活作用属于基于机理的失活(Mechanism-based enzyme inactivation,MBEI)类型,催化过程中底物与活性中心结合破坏丙酮酰基团结构,造成了酶的不可逆失活。该酶在底物浓度500 mM以内其剩余酶活的自然对数与反应时间呈线性相关,利用该线性关系对应的失活速率(k_(obs))建立了催化失活强度的快速表征方法,从而比较文库中不同来源重组酶的催化稳定性强弱。(3)基于文库鉴定了L-天冬氨酸α-脱羧酶催化失活相关自剪切机制的关键氨基酸。利用Tricine-SDS-PAGE分析文库中33株PYR-ADC的电泳条带分布,按照自剪切效率的大小将其分为叁类。结合分类结果和催化活性分析,说明了自剪切加工是获得催化功能结构(即PYR基团)的必要步骤;结合分类结果和系统发育分析,发现Class I和Class III的重组酶在自剪切加工位点附近的保守氨基酸具有明显差异:Class I的保守氨基酸序列为EGSCA而Class III的为VGSIT。进一步地,通过点突变验证和蛋白结构比较,发现自剪切位点附近的Val23、Ile26、Thr27和Glu56是影响自剪切加工的关键氨基酸位点。(4)基于文库鉴定了L-天冬氨酸α-脱羧酶催化失活相关功能结构域的关键氨基酸。根据文库中不同来源的重组酶的催化稳定性差异和蛋白质结构信息选择了12个突变位点,利用点饱和突变技术构建突变文库,利用基于比色的高通量筛选方法筛选催化活性提高的突变体,进一步动力学参数测定结果发现氨基酸位点Arg3、Ala74和Glu42的突变对酶催化活力的提升有帮助,其中位点Arg3和Ala74是影响催化稳定性的关键氨基酸位点。突变体中R3K较野生型在催化性能上有明显提高:催化效率提升了3倍,催化稳定性提高了66.38%。(5)针对文库发现的非催化失活型PLP-ADC进行了功能鉴定及应用分析。从数据库中查找了6个PLP-ADC编码基因序列,利用基因合成技术获得了PLP-ADC的基因,并通过分别构建含组氨酸和GST标签的表达载体,在大肠杆菌表达系统中对重组酶进行了表达与纯化。结果发现来源于古细菌的3株重组酶具有良好的活性,选择其中酶活最高的PD_(Mja)(6.87 U/mg)进行酶学性质分析,发现该酶最适温度和最适pH分别为80℃和8.0,具有很好的热稳定性。进一步进行酶催化转化的研究发现PLP在反应过程中与底物结合发生了降解,因此反应过程中辅酶PLP的稳定性和回收利用是该酶应用上的主要限制因素。(本文来源于《江南大学》期刊2019-06-01）
王超[4]（2019）在《L-天冬氨酸α-脱羧酶热稳定性改造及全细胞催化制备β-丙氨酸》一文中研究指出L-天冬氨酸α-脱羧酶(L-aspartateα-decarboxylase,EC4.1.1.11,ADC)催化L-天冬氨酸脱去α羧基生成β-丙氨酸。β-丙氨酸在食品、医药、化工等领域具有广泛应用,合成方法主要有化学合成法和生物合成法。相较于化学合成法,生物合成法具有副产物少,操作简便,绿色环保等优点。但是用于催化生成β-丙氨酸的ADC酶活普遍偏低,限制了β-丙氨酸的生物法大规模制备。基于此,本研究对赤拟谷盗来源ADC进行分子改造,提升其催化性能,并利用全细胞催化法制备β-丙氨酸。主要研究结果如下:(1)依据嗜热蛋白的氨基酸内在进化趋势,将位于酶分子表面的Lys和Gly分别突变为Arg和Ala,成功提高了该酶的稳定性。共构建22个突变体。初筛结果显示,大多数突变体酶活及稳定性较野生型相差不大,其中,K49R、K221R、G369A突变体显示出较好的催化性能。酶学性质测定结果表明,K221R突变体比酶活较野生酶提高20.3%;在50℃处理30 min,K49R、K221R和G369A的残余酶活较野生酶提高0.7倍、1.2倍和1.0倍。分子动力学模拟结果显示,突变体K221R、G369A的柔性区域较野生型减少,并且与周围氨基酸产生相互作用力,推测是其热稳定性增强的原因。(2)构建基因工程菌,建立全细胞催化生产β-丙氨酸工艺。研究比较了一次性加入高浓度底物、多次添加底物分批补料催化工艺,野生型菌株最佳补料次数是3次,转化生成β-丙氨酸1079.9 mmol·L~(-1),摩尔转化率为90.0%;K221R菌株和G369A菌株最佳补料次数为4次,转化生成β-丙氨酸分别为1512.2 mmol·L~(-1)和1509.6 mmol·L~(-1),摩尔转化率分别达到94.5%和94.4%。(3)对K221R菌株进行5 L发酵罐高密度发酵实验。通过对诱导剂种类和浓度进行优化,确定最佳诱导剂浓度为终浓度0.8 mmol·L~(-1) IPTG。发酵53 h左右菌体量达到OD_(600)=130,最高酶活为851.6 U·mL~(-1)。采用高密度发酵菌株进行全细胞催化,生成β-丙氨酸1820.0 mmol·L~(-1),摩尔转化率达到91.0%。(本文来源于《江南大学》期刊2019-06-01）
令狐梅,韩来闯,周哲敏,崔文璟[5]（2019）在《L-天冬氨酸-α-脱羧酶基因5′端二级结构对重组表达的抑制机制及消除策略》一文中研究指出探究赤拟谷盗Tribolium castaneum L-天冬氨酸-α-脱羧酶(PanD)与人工高效表达元件适配过程中翻译抑制产生的机制,并发展新的消除策略。首先在枯草芽孢杆菌中利用高效表达元件验证翻译抑制现象并分析了翻译抑制产生的机制,同时融合sfGFP考察其对翻译抑制的影响,筛选与PanD酶适配性强的精简融合肽。结果显示,强组成型启动子不能介导PanD高表达,呈翻译抑制。分析证实,panD转录后mRNA的5′编码区与5′UTR形成抑制性的二级结构,降低翻译起始效率。将两种报告基因和其N端部分序列作为绝缘肽分别与PanD的N端融合后均能够提升重组蛋白的表达水平,消除由mRNA分子内部的顺式作用导致的翻译抑制现象。这为深入探索利用通用型肽绝缘子元件稳定异源基因在底盘中的表达提供依据。(本文来源于《食品与发酵工业》期刊2019年16期）
王超,叶文琪,薛岚,刘中美,周哲敏[6]（2019）在《赤拟谷盗来源天冬氨酸α-脱羧酶分子改造及催化合成β-丙氨酸工艺的建立》一文中研究指出L-天冬氨酸α-脱羧酶活性较低,稳定性较差,使得其在工业应用中受到限制。该研究旨在提高L-天冬氨酸α-脱羧酶的催化性能,促进生物法生产β-丙氨酸的工业化进程。依据嗜热蛋白酶的氨基酸内在进化趋势,对赤拟谷盗来源L-天冬氨酸α-脱羧酶进行分子改造,以期提高稳定性。实验共构建21个突变体,获得催化性能优良的突变体K221R,该突变体的比酶活较野生型提高20. 3%;野生型经50℃处理30 min,残余酶活接近0,而突变体K221R的残余酶活为43%。建立了基因工程菌全细胞催化天冬氨酸生成β-丙氨酸的工艺,K221R菌株的产量达到134. 72 g/L,摩尔转化率为94. 52%,是迄今为止的最高产量。该研究构建的基因工程菌具有工业应用潜力,同时也为生物法制备β-丙氨酸提供理论与技术基础。(本文来源于《食品与发酵工业》期刊2019年11期）
汪芳,杨套伟,周俊平,徐美娟,张显[7]（2018）在《提高天冬氨酸β-脱羧酶在酸性环境中催化活力的分子改造》一文中研究指出克隆了德阿昆哈假单胞菌(Pseudomonas dacunhae)来源的L-天冬氨酸β-脱羧酶基因(Asd),实现其在Escherichiacoli中的异源表达,但该酶在酸性环境中活性较低,不利于工业生产.为通过定点突变技术提高该酶在酸性环境中的活力,选择底物通道区域内的5个氨基酸残基作为突变位点,构建6个突变体,随后分析突变体的酶学特性.结果表明,相比于野生型Asd,大多数突变体的比酶活显着下降,只有突变体N34D比酶活(71.67 U/mg)比野生型(65.95 U/mg)略高;另外,突变体N34D在3.5 <pH <5.5酸性环境中的酶活力与野生型Asd相比均得到了提高,其中pH5.0条件下突变体N34D相对酶活达到82%,而野生型Asd相对酶活只有50%左右;而在pH 5.5-8.5范围内突变体N34D的酶活力与野生型相当.最后将突变体N34D应用于催化合成L-丙氨酸,在最适催化条件(pH 5.5)下,突变体N34D催化合成L-丙氨酸的产量是野生型Asd的1.5倍.本研究通过对德阿昆哈假单胞菌来源的N34位点进行突变,成功提高了天冬氨酸β-脱羧酶在酸性环境中的酶活力,并提高了其合成L-丙氨酸的能力,这对酶法生产L-丙氨酸具有重要的指导意义.(本文来源于《应用与环境生物学报》期刊2018年06期）
汪芳[8]（2018）在《Pseudomonas dacunhae L-天冬氨酸β-脱羧酶的耐酸性分子改造及催化合成L-丙氨酸研究》一文中研究指出L-丙氨酸(L-alanine)因具有多种生理生化功能而被广泛应用于食品、医药、化学合成等领域。L-天冬氨酸β-脱羧酶(L-Aspartateβ-decarboxylase)是目前已知的唯一一个氨基酸β脱羧酶,能催化L-天冬氨酸脱羧生成L-丙氨酸。直接投入L-天冬氨酸后反应液的pH会快速降低,而该酶在偏酸条件下酶活低甚至失活。鉴于此,本研究利用定点突变技术对L-天冬氨酸β-脱羧酶进行耐酸性改造,以期提高其在酸性环境中的酶活力。主要结论如下:(1)将来源于P.dacunhae中编码L-天冬氨酸β-脱羧酶的基因aspD克隆至大肠杆菌BL21(DE3)中,构建重组菌E.coli BL21/pET28a-aspD;经诱导表达,SDS-PAGE结果显示目标蛋白多为包涵体形式,采用切除N端His_6标签的方法成功提高了蛋白的可溶性表达,测定破壁上清中L-天冬氨酸β-脱羧酶酶活为72.47 U·m L~(-1),比酶活为11.56 U·mg~(-1),而大肠杆菌原始菌中未测到L-天冬氨酸β-脱羧酶酶活。(2)重组菌细胞破碎上清液采用镍柱亲和层析法得到纯化的L-天冬氨酸β-脱羧酶,纯化后的L-天冬氨酸β-脱羧酶的酶活为12.2 U·mL~(-1),比酶活为65.95 U·mg~(-1)。酶学性质研究结果表明,重组L-天冬氨酸β-脱羧酶最适反应温度为45℃,最适pH为5.5,在35℃-45℃以及pH 5.5-7.0范围内具有较好的稳定性。所考察的金属离子对L-天冬氨酸β-脱羧酶酶活没有明显的促进作用。(3)对L-天冬氨酸β-脱羧酶进行耐酸性改造,选择不同来源的L-天冬氨酸β-脱羧酶的蛋白序列进行比对,并且对该蛋白的叁维立体构造进行分析后选择靠近活性中心的6个氨基酸残基进行定点突变,共获得7株突变体。其中突变体酶N34D、L484M比酶活分别比原始酶提高8.67%和10.36%。对各突变体酶的酶学性质研究结果表明除了N34D的最适反应温度为50℃,L484M与原始酶的最适反应温度相同均为45℃;二者的最适反应pH也与原始酶相同,均为5.5;pH 4.5条件下,突变体酶N34D和L484M的相对酶活分别比原始酶提高了14%和40%;pH 5.0条件下,突变体酶N34D和L484M的相对酶活分别比原始酶高30%和36%。选择突变后酶活和耐酸性均有所提高的第34位和第484位的氨基酸残基进行组合突变,构建组合突变株,对组合突变体酶N34D/L484M纯化后进行酶活测定和酶学性质分析,结果表明N34D/L484M的比酶活达116.27 U·mg~(-1),比原始酶提高了76.30%,最适反应温度与原始酶相同(45℃),在30℃-50℃的温度范围内半衰期均>48 h;pH5.0时相对酶活残余93%,而原始酶仅有51%,最适pH和pH稳定性与原始酶相比相差不大。(4)以组合突变株N34D/L484M细胞为催化剂,从转化温度、转化pH以及缓冲液浓度叁个方面对全细胞转化L-天冬氨酸生成L-丙氨酸的条件进行优化,结果表明最适转化温度为40℃,最适转化pH为5.5,最适缓冲液为0.2 mol·L~(-1)的醋酸缓冲液。在优化后的条件下进行全细胞转化,结果表明,N34D/L484M能在12 h内转化75 g·L~-11 L-天冬氨酸生成50.05 g·L~(-1)的L-丙氨酸,摩尔转化率达99.6%,L-丙氨酸生成速率为4.17g·L~(-1)·h~(-1)。而在相同条件下,未突变菌株E.coli BL21/pET28a-aspD 20 h内只能转化生成33.26 g·L~-11 L-丙氨酸,摩尔转化率为66.2%,L-丙氨酸生成速率为2.15 g·L~(-1)·h~(-1)。对组合突变株N34D/L484M进行5 L罐补料流加发酵,转化27 h时,生成371.05 g·L~-11 L-丙氨酸,摩尔转化率达到92.3%,产量是突变前菌株的1.52倍。(本文来源于《江南大学》期刊2018-06-01）
张腾辉[9]（2018）在《L-天冬氨酸α-脱羧酶的表达、改造及全细胞制备β-丙氨酸》一文中研究指出β-丙氨酸是一种天然的β型氨基酸,是重要的医药前提物质,在保健食品及化工产品中有重要的应用。与化学法合成β-丙氨酸相比,生物转化法具有清洁环保、转化率高、条件温和、副产物少等优势。但用于合成β-丙氨酸的L-天冬氨酸α-脱羧酶(ADC)酶活性普遍偏低,且存在严重的机理性反应失活现象,使酶的利用率较低,因此筛选更高活性的L-天冬氨酸α-脱羧酶,以及弱化酶的机理性反应失活现象和改善酶学性质,使酶具有更有优良的催化特性,利于高效制备β-丙氨酸。本论文异源高效表达了ADC酶,实施定点突变,提高酶活力,弱化ADC蛋白的机理性失活,实现了高效催化β-丙氨酸。(1)将来源于枯草芽孢杆菌、谷氨酸棒状杆菌和植物乳杆菌的L-天冬氨酸α-脱羧酶基因(L-aspartateα-decarboxylase,PanD)分别连接到pET-28a载体上,于大肠杆菌中表达。在16℃、180 r·min~(-1)条件下诱导12 h。经SDS-PAGE验证,观察到大小不同的两条条带,且诱导表达后粗酶液可以转化Asp产生β-丙氨酸,说明叁种来源的ADC蛋白都成功表达,且能自我剪切成熟。利用E.coli BL21/pET28a-BsPanD菌株进行初步的全细胞转化验证实验,确认ADC蛋白可以转化Asp生成β-丙氨酸。(2)利用亲和层析的方法,对叁种来源的ADC蛋白进行纯化,纯化后的蛋白纯度在90%以上。测定BsADC、CgADC和LpADC的最适温度分别为65、70和70℃,BsADC、CgADC和LpADC叁种蛋白的最适pH分别为7.0、6.5和6.5。在叁种酶中,BsADC在酶活和稳定性均较好,因而选择该酶进行后续研究。(3)对BsADC活性中心附近的Tyr58、Ile60、Glu56、Asn41和Lys63五个位点进行定点突变。保守位点Tyr58位的7种突变和Ile60位的饱和突变会影响BsADC酶的剪切成熟,使BsADC失活或活性降低;Asn41Gly、Glu56Ser和Lys63Glu叁个突变点不影响酶的剪切成熟,且37℃条件下,酶活相对于原始酶,提高了1.3-1.6倍。E56S的温度稳定性也略有提升,而N41G和K63E稳定性不变;在减缓机理性反应失活现象上,经过两个小时的反应E56S的残余酶活是原始酶的1.4倍,而N41G和K63E没有明显改善或弱化ADC酶的机理性反应失活现象。(4)将E56S基因分别构建在pET-28a、pMA-5和pXMJ-19叁种载体上,然后转化到大肠杆菌、枯草芽孢杆菌和谷氨酸棒状杆菌叁种宿主细胞中。然后采用5 L的发酵罐进行诱导培养,收集的菌体在37℃、pH 7.0和600 r·min~(-1)条件下,进行全细胞转化。经过9 h的转化,E.coli BL21/pET28a-E56S转化获得215.3 g·L~(-1)的β-丙氨酸,摩尔转化率高达94%。(本文来源于《江南大学》期刊2018-06-01）
高震[10]（2018）在《亚热带红树林土壤沉积物中产L-天冬氨酸α-脱羧酶的菌株Providencia sp.GZ1的鉴定及酶学特性研究》一文中研究指出L-天冬氨酸α-脱羧酶(L-aspartateα-decarboxylase,PanDEC4.1.1.11)是微生物泛酸(由泛解酸和β-丙氨酸组成)生物合成途径中的关键酶,由panD基因编码,以丙酮酰基为催化活性中心,具有严格的底物特异性,可以催化L-天冬氨酸脱去α竣基生成β-丙氨酸。β-丙氨酸的合成途径只存在于微生物和植物细胞中,因此以L-天冬氨酸α-脱羧酶为靶点设计的抗真菌、抗细菌药物和除草剂对动物或人类无害。β-丙氨酸可用于合成肌肽、泛酸钙、巴柳氮及帕米磷酸钠等医药产品,用途非常广泛。目前国内β-丙氨酸主要采用化学合成法,存在成本高、生产条件对环境不友好等缺点,开发绿色安全的生物法生产工艺将具有十分明显的经济和社会效益。但目前筛选到的产酶菌株产酶量较低、酶活性低,难以规模化生产和广泛应用。本研究通过传统纯培养技术,从亚热带海洋土壤沉积物样品中初步分离筛选到八十株具有L-天冬氨酸α-脱羧酶活性的菌株,经纸层析复筛后选择其中4株酶活力较高的菌株进行菌种鉴定。根据菌株的形态特征、生理生化特性、16SrRNA序列比对分析和系统发育分析,鉴定出这四株菌中有两株属于不动杆菌属(Acinetobacter spp.)、一株属于普罗维登斯菌属(Providencia spp.)、一株属于发光细菌属(Photobacterium spp.)。以普罗维登斯菌株为研究对象,根据GenBank数据库中已有的普罗维登斯菌属天冬氨酸脱羧酶基因(panD)序列设计引物,PCR扩增获得L-天冬氨酸a-脱羧酶基因(panDP)。以 pET-30a(+)为载体、Escherichia coli DH5α为宿主细胞,构建了重组菌。生物信息学分析结果表明panDP基因包含一个长为381 bp的ORF,编码一个由126个氨基酸组成的多肽,分子量预测为 13.92 kDa。panDP基因在核苷酸水平上与 Photorhabdus asymbiotics ATCC43949 的 aspartate 1-decarboxylase precursor 基因(GenBank 登录号:FM162591.1)的一致性为 81%;与 Photorhaadus temperata subsp.thracensis strain DSM15199 的 aspartate decarboxylase 基因(GenBank 登录号:CP011104.1)的一致性为77%;在氨基酸水平上,PanDP与来自Providencia rettgeri的L-天冬氨酸α-脱羧酶(GenBank登录号:WP036958294.1)具有98%的一致性,但尚未发现其功能特征研究的相关报道。将构建好的重组质粒pET-30a-panDP转入表达宿主E.coli(DE3)plysS中,构建重组表达菌株。诱导表达的最佳条件为:以终浓度10 g/L的α-乳糖为诱导剂,30℃诱导10h。镍柱纯化蛋白进行酶学性质分析,结果表明:在以L-天冬氨酸为底物时,PanDP的最适反应温度为60℃,最适pH为8.0,在最适反应条件下,金属离子的终浓度为5mM时,Ca2+、A13+、Fe3+对酶具有促进作用,其中A13+的促进作用最高,可达到140%。而Na+、Ba2+、Mn2+、Mg2+、Zn2+、Cu2+均有不同程度的抑制作用,Na+的抑制作用比较微弱,Mn2+、Mg2+、Cu2+的抑制作用比较明显。该酶在低温条件下,比较稳定,超过55℃后,随着时间的延长,稳定性变差,但该酶在80℃下,保存1h,仍具有40%的酶活。当pH值为8.0时,该酶稳定性最好,在pH值为5.0到9.5的范围内,仍保持40%以上的酶活力,在pH值为7.5到8.5的范围内,保持60%左右的酶活力;Km为0.01602 mmol/L,Vmax为1.6861μmol/min,kcat 值为 0.28 s-1。对panDP基因进行定点突变,获得了四个突变体,分别为K9A,K9D,S25E,S25K;纯化这四个突变体蛋白,进行酶学性质研究,与野生重组酶PanDP相比,这四个突变体酶活性均丧失,由此可知氨基酸残基位点的第9位和第25位均与酶的活性相关。本研究完成了Providencia sp.GZ1和Acinetobacter sp.GZ8野生型菌株的鉴定,panDP基因的高效表达和功能分析;PanDP酶的最适反应温度较高,达到60℃,在80℃下仍保留较高的酶活,较高的酶反应温度使其在工业生产中有一定的应用价值和参考价值。(本文来源于《广西大学》期刊2018-06-01）
天冬氨酸脱羧酶论文开题报告
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
丙氨酸作为一种重要的平台化合物,是合成含氮化合物的前体。相较于化学合成法,人们更倾向于利用L-天冬氨酸-α脱羧酶(ADC)环保地制备β-丙氨酸。由于细菌来源的ADC存在严重的机理性底物失活,限制了其在工业上的应用。实验在大肠杆菌中表达了3种古细菌来源的ADC,纯化和测定了其对于L-天冬氨酸的脱羧活性。考察了来源于詹氏甲烷球菌的重组酶(ADC_(M.j))的酶学性质和辅酶磷酸吡哆醛的稳定性,进行了酶转化实验。重组酶ADC_(M.j)的比酶活为6.87U/mg,最适温度和pH分别为80℃和8.0,具有很强的热稳定性,适合用于工业生产。这类磷酸吡哆醛依赖型ADC,酶催化中没有基于机理的底物失活作用,但其辅酶的稳定性和循环利用是其酶催化中的主要限制因素。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
天冬氨酸脱羧酶论文参考文献
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