杜氏盐藻类胡萝卜素合成关键酶基因的克隆及功能验证

论文摘要

杜氏盐藻（Dunaliella sallina）是无细胞壁的真核绿藻,可以在极端环境下大量积累类胡萝卜素。解析参与胡萝卜素合成基因的功能有助于具突破性状盐藻优异种质的定向培育和建立富集特定天然产物的工程株系,以期为高值盐藻产品的商业化生产提供科学依据。为此,本研究以杜氏盐藻Ds-YC011藻株为试材,以杜氏盐藻类胡萝卜素合成途径中的关键酶基因DsLYCB和DsLYCE为靶标,克隆这两个关键基因的编码序列和构建表达载体。通过农杆菌介导烟草瞬时表达和应用电击转化法将靶基因导入杜氏盐藻细胞并使其有效表达,鉴定这两个酶基因的生物学功能,进而培育高产类胡萝卜素的优异盐藻株系。主要研究结果如下:1.从运城盐湖水样中分离并纯化获得试验用盐藻藻株,细胞形态学和18S rDNA分子鉴定其为杜氏盐藻的一个新株系（Ds-YC011）。2.针对表达载体携带抗潮霉素筛选标记基因,通过检测杜氏盐藻细胞对不同潮霉素的敏感性,确定固体和液体培养筛选阳性转化体的潮霉素浓度分别为200μg/mL和800μg/mL。3.利用高保真RT-PCR的方法成功分离获得盐藻DsLYCB和DsLYCE基因编码序列。生物信息学分析显示,DsLYCB为不稳定亲水性蛋白,无跨膜结构。二级结构中α-螺旋结构最多,占39.9%。DsLYCE为不稳定亲水性蛋白,有跨膜结构。二级结构中无规则卷曲结构最多,占43.27%。同源比对和系统进化分析表明,杜氏盐藻DsLYCB、DsLYCE蛋白与雨生红球藻的相似性最高。4.高盐胁迫显著上调杜氏盐藻DsLYCB和DsLYCE基因的表达量,在胁迫4 h时表达量最高,且类胡萝卜素含量亦达峰值。DsLYCB和DsLYCE基因表达水平与类胡萝卜素富集呈正相关。5.为探讨DsLYCB和DsLYCE在高等植物中是否调控类胡萝卜素的合成,本研究构建了这两个基因植物表达载体pCAMBIA1303+DsLYCB和pCAMBIA1303+DsLYCE,并采用农杆菌介导使这两个基因分别在烟草叶片组织中瞬时表达。转烟草叶片生化分析显示,目的基因瞬时表达烟草叶片的类胡萝卜素含量比野生型增加24%,其中β-胡萝卜素增加42.3%。此外,转基因叶片的叶绿素a和叶绿素b含量也显著高于野生型烟草及转空载烟草叶片的含量（P<0.05）。这表明杜氏盐藻DsLYCB和DsLYCE基因在高等植物中能正常行使功能,促进类胡萝卜素的合成与积累。6.建立了基于电击转化法的杜氏盐藻遗传转化体系,将DsLYCB和DsLYCE分别成功导入杜氏盐藻细胞,并获得目的基因有效表达。7.对盐藻生物量以及类胡萝卜素含量检测表明,转基因盐藻细胞生长情况与野生型基本一致。转基因盐藻细胞类胡萝卜素总量和β-胡萝卜素的积累量显著高于野生型的含量（P<0.05）。总之,本研究分离获得具有催化功能的杜氏盐藻DsLYCB和DsLYCE基因,并建立了基于电击转化的杜氏盐藻遗传转化体系。这为未来建立高效的盐藻遗传转化体系奠定了基础,也为建立杜氏盐藻高产类胡萝卜素等高附加值产物的调控策略和应用提供了理论依据和技术支撑。

论文目录

• 摘要
• 第一章 绪论
•   1.1 类胡萝卜素
•     1.1.1 类胡萝卜素种类结构及其用途
•     1.1.2 类胡萝卜素的生物合成
•   1.2 杜氏盐藻及其类胡萝卜素的生物合成和研究进展
•     1.2.1 杜氏盐藻概述
•     1.2.2 杜氏盐藻类胡萝卜素的生物合成
•     1.2.3 杜氏盐藻番茄红素β-环化酶（LYCB）
•     1.2.4 杜氏盐藻番茄红素ε-环化酶（LYCE）
•     1.2.5 本文研究的目的及意义
•   1.3 技术路线
• 第二章 运城盐湖杜氏盐藻分离及抗生素筛选
•   2.1 引言
•   2.2 试验材料
•     2.2.1 藻种
•     2.2.2 试验仪器
•     2.2.3 主要试剂
•   2.3 试验方法
•     2.3.1 藻种的培养及纯化
•     2.3.2 藻种分子学鉴定
•     2.3.3 杜氏盐藻细胞对潮霉素的耐受性检测
•   2.4 结果与分析
•     2.4.1 从运城盐湖水样中分离纯化获得一株杜氏盐藻新株系
•     2.4.2 潮霉素对杜氏盐藻生长的影响
•   2.5 讨论与结论
• 第三章 杜氏盐藻LYCB、LYCE基因克隆及表达分析
•   3.1 引言
•   3.2 材料与方法
•     3.2.1 试验材料
•     3.2.2 试验方法
•   3.3 结果
•     3.3.1 杜氏盐藻LYCE、LYCB基因克隆
•     3.3.2 杜氏盐藻DsLCYE、DsLCYB酶蛋白特性的生物信息学分析
•     3.3.3 杜氏盐藻DsLYCE、DsLYCB与其他植物LYCE、LYCB蛋白系统进化分析
•     3.3.4 杜氏盐藻DsLYCE、DsLYCB在高盐胁迫下的表达分析及其对类胡萝卜素积累的影响
•   3.4 讨论与结论
• 第四章 杜氏盐藻LYCB、LYCE表达载体构建及烟草瞬时表达
•   4.1 引言
•   4.2 试验材料与方法
•     4.2.1 植物材料
•     4.2.2 菌株、质粒及试剂
•     4.2.3 构建植物表达载体pCAMBIA1303+DsLYCB和 pCAMBIA1303+DsLYCE
•     4.2.4 农杆菌GV3101 感受态的制备及质粒转化
•     4.2.5 农杆菌介导的烟草瞬时表达分析
•     4.2.6 烟草瞬时表达叶片GUS染色
•     4.2.7 烟草瞬时表达的PCR检测
•     4.2.8 烟草叶片色素提取
•   4.3 结果
•     4.3.1 表达载体的双酶切鉴定
•     4.3.2 阳性农杆菌的检测
•     4.3.3 烟草叶片GUS染色
•     4.3.4 烟草瞬时表达DsLYCE、DsLYCB的 PCR检测
•     4.3.5 烟草叶片色素分析
•   4.4 讨论
• 第五章 杜氏盐藻LYCB和 LYCE的遗传转化及其表型分析
•   5.1 引言
•   5.2 试验材料
•     5.2.1 藻种和质粒载体
•     5.2.2 试验仪器
•     5.2.3 试验试剂
•   5.3 试验方法
•     5.3.1 试验材料准备
•     5.3.2 电击转化杜氏盐藻细胞
•     5.3.3 转基因阳性藻细胞的筛选
•     5.3.4 GFP报告基因在杜氏盐藻细胞中的表达
•     5.3.5 潮霉素抗性转化藻株的分子鉴定
•     5.3.6 转基因盐藻生物量的测定
•     5.3.7 转基因盐藻细胞内色素含量的测定
•   5.4 结果
•     5.4.1 杜氏盐藻转化株的分子鉴定
•     5.4.2 杜氏盐藻转化株中GFP报告基因的检测
•     5.4.3 转基因杜氏盐藻生物量的分析
•     5.4.4 转基因杜氏盐藻细胞内类胡萝卜素含量的测定
•   5.5 讨论
• 全文总结
• 参考文献
• Abstract
• 硕士期间发表论文
• 致谢

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 安茜

导师: 王计平

关键词: 杜氏盐藻,本氏烟草,电击转化,瞬时表达,类胡萝卜素,番茄红素环化酶基因

来源: 山西农业大学

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学,生物学

单位: 山西农业大学

基金: 国家农业部“948”项目(#2014-Z39),国家自然科学基金(#31401430,#30971806,#31201266),山西省煤基重点科技攻关项目(#FT-2014-01),山西省自然科学基金项目(2010011039-1),山西省重点研发计划项目(201803D221005-9,201603D312005),山西省晋中市科技重点研发计划项目(Y172007-5)

分类号: Q943.2

DOI: 10.27285/d.cnki.gsxnu.2019.000358

总页数: 70

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