方斌
浙江大学医学院附属儿童医院浙江杭州310052
【摘要】目的：探讨硝酸甘油溶液中有关物质的含量测定方法。方法：采用高效液相色谱法，色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶柱DiamonsilC18（4.6mm×150mm，5μm），以乙腈-水（50∶50）为流动相，于波长为215nm处检测。结果：硝酸甘油在1.86~9.83μg/ml范围内峰面积A与浓度C有高度相关性，线性关系良好，硝酸甘油溶液的最小检出浓度为1．82μg/ml，有关物质的含量分别为0.27%，0.24%，0.19%；结论：采用高效液相色谱法测定硝酸甘油溶液中有关物质，简便，快捷，灵敏度好，能准确地测定产品的有关物质。
【关键词】硝酸甘油；HPLC法；有关物质；含量测定
硝酸甘油溶液（NitroglycerinSolution）为无色的澄明液体，有乙醇的特臭，相对密度为0.835～0.850，用于冠心病心绞痛的治疗及预防，也可用于降低血压或治疗充血性心力衰竭。硝酸甘油在放置过程中容易产生水解作用，在高温条件下也易产生降解作用，故需控制其有关物质的限度。高效液相色谱法（HighPerformanceLiquidChromatography，HPLC），系采用高压输液泵将流动相泵入到装有填充剂的色谱柱，对供试品进行分离测定的色谱方法。硝酸甘油注射液的质量标准中规定，在产品生产过程半成品和成品检验，需用高效液相色谱法测定其含量。本文采用HPLC法对硝酸甘油溶液有关物质测定，简便，快捷，灵敏度好，能准确地测定产品的有关物质。
1仪器与试药
仪器：CLASS-VP工作站，岛津ShmadzuLC-2010A，色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶柱DiamonsilC18（4.6mm×150mm，5μm），HypersiBDS-C18；UV160-A紫外分光光度计。
试药：硝酸甘油溶液（北京益民药业有限公司，批号：20170801，20170802，20170803）；乙腈（色谱纯，默克公司）。
2试验步骤
2.1色谱条件
以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；乙腈-水（50：50）为流动相；检测波长215nm；流速：1.0mL/min，进样量10μL。
2.2供试溶液的制备
供试品溶液：精密量取本品适量，加流动相稀释并制成每毫升中含硝酸甘油1mg的溶液，作为供试品溶液。
对照品溶液：精密量取供试品溶液适量，加流动相稀释并制成每毫升中含硝酸甘油5μg/的溶液，作为对照品溶液。
2.3检测波长的选择
取对照品溶液，在190~300nm进行扫描，在200nm处有最大吸收，考虑到200nm位于紫外吸收的末端，且参考2000年版《中国药典》硝酸甘油溶液含量测定方法，选择215nm作为检测波长。
2.4专属性试验
取硝酸甘油溶液适量，用流动相稀释制成浓度1mg/ml的溶液，分别进行氧化破坏试验、酸破坏试验、碱破坏试验、光照破坏试验和高温试验。氧化破坏试验为取10ml上述溶液，
加入30的双氧水溶液1.4ml，摇匀，调节pH至中性后，进行HPLC分析试验；酸破坏试验为取10ml上述溶液，加入1mol/L的HCl溶液10ml，摇匀，放置30min，调节pH至中性后，进行HPLC分析试验；碱破坏试验为取10ml上述溶液，加入0.1mol/LNaH溶液1ml，摇匀，2min后调节pH至中性，进行HPLC分析试验；光照破坏试验为取硝酸甘油溶液5ml，置4500LX强光下照射10天后，进行HPLC分析试验；高温试验为取硝酸甘油溶液10ml，置沸水浴中加热，取出放冷，进行HPLC分析试验。
专属性试验结果显示：酸、碱和氧化破坏都能使硝酸甘油产生较大的降解产物。这些降解产物在本色谱条件下均能与硝酸甘油主峰明显分离，故此方法用于检测有关物质专属性较好。
2.5线性范围
取供试品溶液适量，用流动相制成99.0μg/ml的溶液，分别取0.2、0.4、0.6、0.8、1.0ml上述溶液，用流动相稀配成10.0ml，照本色谱条件进行测定，结果表明在1.86~9.83μg/ml范围内峰面积A与浓度C有高度相关性，可用此法作为有关物质检查的方法。见表1
2.6测定检测限
本法检测限按信噪比3作为最小检测限，测得硝酸甘油溶液的最小检出浓度为1.82μg/ml。
2.7有关物质含量测定
色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；乙腈水（50：50）为流动相；检测波长215nm。理论塔板数按硝酸甘油峰计算应不低于2000。硝酸甘油峰与相邻杂质峰的分离度应符合要求。取本品，用流动相溶解制成每毫升中含硝酸甘1mg的溶液，作为供试品溶液；精密量取适量，加流动相稀释成每毫升中含5μg的溶液，作为对照溶液。分别进样10μL，记录色谱图至主成分保留时间的2倍，供试品溶液的色谱图中如有杂质峰，各杂质峰的峰面积之和不得大于对照溶液主峰面积（0.5%），见表2.
3.结果
硝酸甘油在1.86~9.83μg/ml范围内峰面积A与浓度C有高度相关性，线性关系良好，硝酸甘油溶液的最小检出浓度为1．82μg/ml，测得有关物质的含量分别为0.27%，0.24%，0.19%。
4.讨论
有关物质是研究药品中除主成分以外的杂质，它可能是原料药合成过程中带入的原料、中间体、试剂、降解物、副产物、聚合体、异构体以及不同晶型、旋光异构的物质，也可能是制剂过程中产生的降解物，或是在贮藏、运输、使用过程中产生的降解物等。这些杂质的存在直接反映药品的有效性和安全性，故要对其进行研究，目前，有关物质的常用测定方法有高效液相色谱法（HPLC法）和薄层色谱法（TLC法）。
高效液相色谱法，注入的供试品，由流动相带入注内，各组分在柱内被分离，并依次进入检测器，由积分仪或数据处理系统记录色谱图并进行数据处理，得到测定结果。由于应用了各种特性的微粒填料和加压的液体流动相，具有分离性能高、分析速度快的特点。
专属性试验是提供被分析物在杂质和辅料存在时能被区分的证明，该点是色谱条件建立的关键。通常采用在被分析物的对照品或精制品中加入一定量的杂质或辅料，证明色谱条件可将各杂质与被分析物分离[1]。这里的关键是：将多少量的杂质加入到多少量的主成分中。正确的作法是将1%（w/w）浓度量的各杂质加入到100%浓度的主成分中，配制这样的溶液来验证系统适用性。
供试品溶液浓度的设定在有关物质检测中是至关重要的，浓度越高、越能反映样品中杂质存在的情况，但若设定得过高，则会产生主斑点严重拖尾、“断腰”等超载现象的发生，产生错误结论；若设定太低，又将达不到检测杂质的目的，观测不到杂质量的变化。
强力破坏试验是为了揭示原料药内在稳定性的特性，它是开发研究的一部分。这些试验是在比加速试验更剧烈的条件下进行的，其能够包含药品在销售过程中所遇到的剧烈条件。可取一批样品通过强光、高温、高湿、氧化破坏、以及酸碱破坏来证明该展开条件能分离检测出杂质。
专属性试验结果显示：酸、碱和氧化破坏都能使硝酸甘油产生较大的降解产物。这些降解产物在本色谱条件下均能与硝酸甘油主峰明显分离，故此方法用于检测有关物质专属性较好。
本试验结果显示硝酸甘油在1.86~9.83μg/ml范围内峰面积A与浓度C有高度相关性，线性关系良好，硝酸甘油溶液的最小检出浓度为1．82μg/ml，测得有关物质的含量分别为0.27%，0.24%，0.19%，因此，采用高效液相色谱法测定硝酸甘油溶液中有关物质，简便，快捷，灵敏度好，能准确地测定产品的有关物质。
参考文献：
[1]万莉，李万平，阎睿，崔小平；硝酸甘油片中有关物质检查探讨[J].中国药师，2014，17（8）
[2]王琳，余倩，张喆，郑洁，古海锋；硝酸甘油片有关物质方法的辅料扣除及质谱定性研究[J].药物分析杂志，2013（11）
通讯作者：方斌，通讯邮箱：6513107@zju.edu.cn