论文摘要
氮循环是全球生物地球化学循环的重要组成部分,而硝化作用被认为是氮循环的关键步骤。土壤中的硝化作用是造成氮素损失的重要原因,影响了植物对氮素的有效利用。硝化作用过程中产生的硝酸盐以及氧化亚氮（N2O）等会对自然环境产生一定的负面影响。人们对硝化作用的传统认知是其由两类不同的微生物群落,氨氧化微生物（Ammonia-oxidizing microorganism,AOM）和亚硝酸氧化细菌（Nitrite-oxidizing bacteria,NOB）分两步完成的。但全程氨氧化细菌（Complete ammonia oxidizers,Comammox）的发现正在改变我们的传统认知,它能够直接完成从氨氮到硝氮的转化。这需要我们有更多的工作去重新评估土壤中的硝化作用。水稻土是我国主要的耕作土壤之一,目前我国水稻的氮肥利用率较低,施肥会对水稻土中的硝化作用以及硝化微生物产生重要的影响。本次试验选用耕作施肥（T）以及休闲（不耕作、不施肥,F）两种不同管理模式下的水稻土,利用稳定性同位素核酸探针技术进行56天的培养试验,重点对水稻土中的全程氨氧化细菌展开探究。对刚采集回来的新鲜样品稍作处理即测定土壤硝化潜势。在不添加氮源（-CK）和添加氮源（-N）两种条件下对每种土样设置三种处理,即12CO2对照处理、13CO2标记处理以及13CO2+C2H2抑制对照处理。土壤样品放置在28℃的恒温培养箱中进行56天的培养,每周根据各处理的要求添加N 50 mg·kg-1和相应体积的气体。培养完成后,对第0天（Day-0）以及培养56天（Day-56）的样品进行分析测定。测定指标包括有pH、硝化潜势、硝态氮含量、铵态氮含量;利用实时荧光定量PCR测定氨氧化细菌（Ammonia-oxidizing bacteria,AOB）、氨氧化古菌（Ammonia-oxidizing archaea,AOA）、Comammox的分支A（Clade A）及分支B（Clade B）的amoA功能基因丰度;在南京土壤研究所完成对标记结果的判断;利用Hiseq测序技术分析两种水稻土中总的微生物群落组成。试验结果如下:耕作施肥水稻土的硝化潜势远高于不耕作、不施肥的休闲水稻土,分别为24.97 mg·kg-1·d-1、2.11 mg·kg-1·d-1。经过56天的培养后,添加氮源的耕作施肥水稻土（T-N）中12CO2、13CO2处理的NO3--N含量分别为359.46、361.51 mg·kg-1;未添加氮源的耕作施肥水稻土（T-CK）中12CO2、13CO2处理的NO3--N含量分别为81.81、68.45 mg·kg-1。相比于培养初期的13.63 mg·kg-1,12CO2对照处理和13CO2标记处理的NO3--N含量都有显著增长。耕作施肥水稻土在培养期间进行了较为强烈的硝化作用,添加氮在一定程度上促进了硝化作用的发生。添加氮源的休闲水稻土（F-N）12CO2、13CO2处理下的NO3--N含量由培养初期的9.5 mg·kg-1分别增长到87.44、88.71 mg·kg-1;未添加氮源的休闲水稻土（F-CK）中12CO2、13CO2处理的NO3--N含量分别为11.04、12.89 mg·kg-1,与培养初期相比并未有明显变化,表明硝化作用基本未进行。休闲水稻土未进行明显的硝化作用主要是因为底物的匮乏。在添加硝化抑制剂C2H2的13CO2+C2H2处理中,NO3--N的含量均未有明显的增长,说明C2H2的抑制作用明显,此次试验中所采用的水稻土的硝化作用类型以自养硝化为主。培养初期,耕作施肥水稻土中AOB、AOA以及Comammox Clade A的丰度均高于休闲水稻土,而Comammox Clade B却低于休闲水稻土。经过56天的培养后,无论氮源添加与否,耕作施肥水稻土12CO2、13CO2处理下AOB和AOA的amoA基因拷贝数相较于培养初期均有一定增加,而在13CO2+C2H2处理中则有所下降;添加氮源的休闲水稻土12CO2、13CO2处理中的AOA amoA基因拷贝数相比于培养初期有显著增长。培养结束后Comammox Clade A amoA基因的拷贝数在各处理中均有不同程度的降低;而Comammox Clade B amoA基因的拷贝数在不添加氮源以及添加氮源的耕作施肥水稻土12CO2、13CO2处理下都有较为明显的增长。通过CsCl超高速密度梯度离心,将培养结束后提取的土壤样品总DNA分为15层,每一层的浮力密度有所不同。13C-DNA会处在浮力密度较高的重层,而12C-DNA处于浮力密度较低的轻层。所得的各层DNA纯化后通过实时荧光定量PCR进行amoA基因的定量,进一步鉴定氨氧化微生物的标记程度。结果表明在此培养期间,添加氮源的耕作施肥水稻土中标记上了AOA以及AOB;未添加氮源的耕作施肥水稻土中AOB、AOA以及Comammox Clade B同时被标记;添加氮源的休闲水稻土仅标记了AOA。对13C-DNA依据标记结果进行基于amoA功能基因的高通量测序,分析测序结果得出参与耕作施肥水稻土中硝化作用的活性AOB主要为Nitrosospira Cluster 3,AOA以Group1.1b为主;而在休闲水稻土中活性AOA主要为Group1.1a和Group1.1b。对各处理培养初期和培养后的土壤样品进行的Hiseq测序表明耕作施肥水稻土中微生物群落的多样性要优于休闲水稻土。变形菌门（Proteobacteria）、酸杆菌门（Acidobacteria）、绿弯菌门（Chloroflexi）、放线菌门（Actinobacteria）、硝化螺旋菌门（Nitrospirae）、浮霉菌门（Planctomycetes）和芽单胞菌门（Gemmatimonadetes）等在此次试验所选用的两种水稻土中具有较高的占比。本研究重点探究了水稻土中的全程氨氧化细菌,以及不同管理模式下的两种水稻土中硝化作用的主要参与者。由试验结果得出以下结论:（1）相比于休闲,耕作施肥显著提高了水稻土的硝化潜势;（2）长期休闲使得水稻土中的硝化作用较弱,而添加氮源会在一定程度上促进硝化作用的进行;（3）水稻土中有较高数量级的Comammox分布;（4）相比于休闲管理,耕作施肥对水稻土中AOB、AOA以及Comammox Clade A的丰度有一定的促进作用;（5）AOB和AOA共同参与耕作施肥水稻土中的硝化作用,其中AOB主要为Nitrosospira Cluster 3,AOA以Group1.1b为主;在不添加外部氮源的情况下,Comammox Clade B也参与了硝化过程,所利用的氨氮或许来自土壤的矿化。休闲水稻土中的硝化作用由以Group1.1a和Group1.1b为主的AOA主导进行。
论文目录
文章来源
类型: 硕士论文
作者: 曹彦强
导师: 蒋先军
关键词: 稳定性同位素示踪,水稻土,氨氧化古菌,氨氧化细菌,全程氨氧化细菌
来源: 西南大学
年度: 2019
分类: 基础科学,农业科技
专业: 生物学,农业基础科学,农艺学,农作物
单位: 西南大学
基金: 国家自然科学基金项目(编号:41671232):探索单步硝化作用在土壤硝化作用中的相对贡献,国家重点研发计划(编号:2016YFD0300901):西南旱轮作稻区高产稻田肥力变化特征及培肥耕作途经
分类号: S511;S154.3
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标签：稳定性同位素示踪论文; 水稻土论文; 氨氧化古菌论文; 氨氧化细菌论文; 全程氨氧化细菌论文;