靶向OXA23基因的CRISPR-Cas9载体系统构建

论文摘要

目的:本研究以质粒pet41a为载体骨架,通过双酶切法从质粒pwt-Cas9、pgRNA中获得目的基因片段,构建CRISPR-Cas9载体系统,建立一种行之有效的基因编辑的载体,为研究细菌耐药基因提供方法;使用热转化和电转化两种常用分子技术手段,制备感受态细胞并优化转化条件,获得最大的转化效率。方法:1.收集宁夏医科大学总医院2016-2017年临床分离鉴定的鲍曼不动杆菌菌株105株。2.进行药敏及PCR技术筛选对卡那霉素敏感且含有OXA23基因的菌株。3.选择质粒pet41a、pgRNA和pwt-Cas9,分析质粒核酸序列及酶切位点。使用限制性核酸内切酶XhoI和BgiII分别酶切质粒pet41a和pwt-Cas9,获得具有相同粘性末端的线性质粒片段,回收并用T4DNA连接酶连接,连接产物转化DH5α感受态细胞,转化菌涂布含卡那霉素的固体LB培养基平板进行阳性单克隆筛选并测序,构建的质粒命名为pet41-Cas9。使用BgiII和XbaI两种限制性内切酶分别酶切pet41-Cas9和pgRNA,经回收纯化、连接和转化后筛选阳性单克隆菌落并测序,重组质粒命名为pet41a-Cas9-sgRNA。分别将重组质粒pet41-Cas9和pet41a-Cas9-sgRNA转化BL-21（DE3）,IPTG诱导后提取蛋白进行SDS-PAGE分析。4.选取鲍曼不动杆菌标准菌株ATCC17978,分别用去离子水和氯化钙制备鲍曼不动杆菌感受态细胞,并用制备的感受态细胞做电转化和热转化。结果:从临床上筛选得到2株对卡那霉素敏感且含有OXA23基因的菌株,分别命名为AB7、AB34。测序证实质粒pet41-Cas9、pet41a-Cas9-sgRNA连接正确,载体构建成功。重组质粒转化DE3后经IPTG诱导4 h,表达分子质量单位为160×103的重组蛋白,与Cas9蛋白理论分子质量相符。氯化钙法制备的感受态细胞在热转化条件下有阳性转化菌株生长,去离子水制备的感受态仅电转化下有阳性转化菌株生长。在不同电压转化时,1000v处开始才有阳性转化菌出现,电压越大,生长的菌落数越多。结论:1.成功构建CRISPR-Cas9载体系统质粒pet41a-Cas9-sgRNA并表达重组Cas9蛋白,为细菌基因的编辑研究奠定了前期基础。2.氯化钙法制备的感受态细胞热转化效率略高于去离子水法制备的感受态细胞;电转化效率明显高于热转化,转化效率随电压的增大而提高,在2000v处达到最大值。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 缩略词与中英文对照
• 前言
• 第一部分 OXA23 基因的临床鲍曼菌株筛选
•   材料与方法
•   结果
•   讨论
• 第二部分 靶向OXA23 基因的CRISPR-Cas9 载体构建
•   材料与方法
•   结果
•   讨论
• 第三部分 感受态细胞的制备与条件的优化
•   材料与方法
•   结果
•   讨论
• 参考文献
• 综述
•   综述参考文献
• 致谢
• 攻读学位期间发表的学术论文目录
• 个人简介
• 开题、中期及学位论文答辩委员组成

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 杨勇

导师: 魏军,刘晓明

关键词: 基因,感受态细胞,转化

来源: 宁夏医科大学

年度: 2019

分类: 基础科学,医药卫生科技

专业: 生物学,临床医学

单位: 宁夏医科大学

分类号: R446.5;Q78

总页数: 69

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