新型双功能谷胱甘肽合成酶在毕赤酵母和大肠杆菌中的表达及条件优化

论文摘要

谷胱甘肽（glutathione,y-L-glutamyl-L-cysteinyl-glycine,GSH）是一种由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸缩合而成含巯基的活性三肽,有还原型（G-SH）和氧化型（G-S-S-G）两种形式,只有前者有活性。由于谷胱甘肽含有活泼的巯基,具有许多生理功能,在食品、化妆品以及医药行业都被广泛应用。随着对GSH的了解逐渐加深,GSH的市场需求量也逐渐增大。因此,GSH的工业化生产则显得尤为重要。目前,GSH生产方法主要有溶剂提取法、化学合成法、微生物发酵法和酶法四种。其中酶法是指利用酶来催化三种氨基酸合成GSH的方法。在大多数细胞及革兰氏阴性菌中,GSH的酶法合成由两步构成,由γ-谷氨酸半胱氨酸合成酶（γ-GCS,大肠杆菌中由基因gshA编码,在酵母中由gshⅠ编码）和γ-谷胱甘肽合成酶（GS,大肠杆菌中由gshB编码,在酵母中由gshⅡ编码）分步催化,然而当GSH含量过多时,会与γ-谷胱甘肽合成酶结合,造成中间产物的积累从而降低GSH产量。近年来,在一些细菌中发现了一种能依赖ATP,且同时具有以上两种酶活性的新型酶,即新型双功能谷胱甘肽合成酶,GshF,且据有已有文献报道,来源于大部分细菌的GshF对GSH不敏感。因此,本研究的主要内容:1)首先根据NCBI中已有的gshFSA的序列与pPIC9K、pET-28a上多克隆位点设计两对引物,用高保真PCR的方法从Streptococcus agalatiae中克隆出目的基因gshFSA。再分别构建重组表达载体pPIC9K-gshFSA和pET28a-gshFSA,然后分别转化到GS115和BL21中,通过G418抗性筛选出高拷贝转化子,再进行诱导表达,利用SDS-PAGE技术检测发酵液中GshFSA。用Bradford法分别测粗酶液中的总蛋白含量,其中pPIC9K-gshFSA/GS115发酵液中的总蛋白含量为0.46mg/mL,pET28a-gshFSA/1BL21 发酵液中总蛋白含量为 1.46mg/mL;2)对重组酵母pPIC9K-gshFSA/GS115诱导表达中的甲醇诱导浓度、诱导温度、发酵液pH进行单因素梯度优化。当诱导温度为30℃,GshF表达量最大;当甲醇诱导浓度为2%时,GshF表达量最大;当诱导pH为6.0时,GshF表达量最大;再设计正交实验确定这些因素的最佳组合以便获得最大产量的GSH,结果显示,当甲醇诱导浓度为2.5%、诱导温度为30℃、诱导pH为6.0时,经重组酵母表达的GshF酶活最高,为9.1U/mL。3)对重组工程菌pET28a-gshFSA/BL21诱导表达的温度、诱导时机和诱导剂浓度进行优化。当重组大肠杆菌培养5.5h后.再加入诱导剂IPTG诱导培养7h后所得GshF酶活最高,为12.23U/mL;当诱导温度为34℃时,表达所得酶活最高,可为12.02U/mL;当诱导剂浓度为0.3mmol/L时,诱导表达的GshF酶活最高,为3.91U/mL。还选择了所含酶活最高的菌体进行超声破壁处理,发现破壁后蛋白含量提高了4倍,酶活提高了3倍左右。

论文目录

• 致谢
• 摘要
• Abstract
• 1. 绪论
•   1.1 谷胱甘肽的发现
•   1.2 谷胱甘肽的基本介绍
•     1.2.1 理化性质
•     1.2.2 生理功能
•     1.2.3 应用领域
•   1.3 谷胱甘肽的生产方法
•     1.3.1 溶剂提取法
•     1.3.2 化学合成法
•     1.3.3 酶法
•     1.3.4 微生物发酵法
•   1.4 谷胱甘肽的含量测定
•     1.4.1 HPLC高效液相色谱法
•     1.4.2 紫外分光光度法
•     1.4.3 荧光实验法
•   1.5 新型双功能谷胱甘肽合成酶
•     1.5.1 研究背景
•     1.5.2 结构功能
•   1.6 蛋白表达系统
•     1.6.1 大肠杆菌表达系统
•     1.6.2 酵母表达系统
•   1.7 本论文的研究内容及意义
• 2. 材料与方法
•   2.1 菌株与质粒
•   2.2 仪器与试剂
•     2.2.1 实验仪器
•     2.2.2 工具酶与试剂
•   2.3 培养基
• 3. 新型双功能谷胱甘肽合成酶的克隆与生物信息学分析
•   3.1 材料与仪器
•   3.2 培养基
•   3.3 实验方法
•     3.3.1 实验材料的准备
•     3.3.2 目的基因gshF的回收纯化
•     3.3.3 大肠杆菌感受态细胞的制备
•     3.3.4 目的基因转入感受态细胞
•     3.3.5 生物信息学分析
•   3.4 结果与讨论
• SA基因的克隆'>    3.4.1 gshF_SA基因的克隆
•     3.4.2 生物信息学分析
•     3.4.3 本章小结
• sA的构建和鉴定'>4. 表达载体pPIC9K-gshF_sA的构建和鉴定
•   4.1 材料与仪器
•   4.2 实验方法
• SA的构建'>    4.2.1 表达载体pPIC9K-gshF_SA的构建
•     4.2.2 重组毕赤酵母的转化、筛选与鉴定
•   4.3 结果与讨论
• 5. 新型双功能谷胱甘肽合成酶的重组大肠杆菌载体构建和鉴定
•   5.1 材料与仪器
•   5.2 实验方法
• SA的构建'>    5.2.1 表达载体pET28a-gshF_SA的构建
•     5.2.2 重组大肠杆菌的构建与鉴定
•   5.3 结果与讨论
• SA在毕赤酵母与大肠杆菌中的重组表达与条件优化'>6. GshF_SA在毕赤酵母与大肠杆菌中的重组表达与条件优化
• SA在毕赤酵母菌株中的表达及优化'>  6.1 GshF_SA在毕赤酵母菌株中的表达及优化
•     6.1.1 表达方法
•     6.1.2 单因素表达优化
•     6.1.3 正交实验的设计
• SA在大肠杆菌中的表达及优化'>  6.2 GshF_SA在大肠杆菌中的表达及优化
•     6.2.1 表达方法
•     6.2.2 诱导优化
•   6.3 发酵液和菌体内总蛋白含量的测定
• SA的酶活测定'>  6.4 GshF_SA的酶活测定
•   6.5 结果与讨论
• 7. 结论与展望
•   7.1 结论
•   7.2 展望
• 参考文献
• 作者简介
• 酶法合成谷胱甘肽的研究进展
•   参考文献

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 李佳慧

导师: 王首锋

关键词: 谷胱甘肽,新型双功能谷胱甘肽合成酶,发酵表达

来源: 浙江大学

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学

单位: 浙江大学

分类号: Q55

DOI: 10.27461/d.cnki.gzjdx.2019.001801

总页数: 60

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