导读:本文包含了冻干异体骨论文开题报告文献综述及选题提纲参考文献，主要关键词:同种异体骨移植,环孢菌素同种异体骨,白细胞介素-2,肿瘤坏死因子-α
冻干异体骨论文文献综述
张大伟,李真慧,裴国献[1]（2014）在《复合环孢素同种异体骨与冻干同种异体骨移植后免疫学比较》一文中研究指出目的比较复合环孢菌素同种异体骨(cyclosporine-impregnated allograft bone,CAB)与冻干同种异体骨(freeze-dried allograft bone,FDAB)移植后的免疫学反应。方法 60只新西兰大白兔随机分为材料提供组、实验组和对照组,每组20只。取材料提供组双侧髂骨制备CAB及FDAB。实验组、对照组动物制备右侧桡骨中段10 mm的骨与骨膜缺损,实验组植入CAB修复,对照组植入FDAB修复。术后2周、4周、8周、12周每组各取5只动物,进行全血及移植部位骨组织IL-2、TNF-α浓度测定。结果术后2周、4周、8周、12周血中IL-2、TNF-α浓度两组之间无差异。术后2周、4周移植部位骨组织中IL-2、TNF-α浓度实验组低于对照组(P值分别为0.000、0.015),术后8周、12周移植部位骨组织中IL-2、TNF-α浓度两组之间差异均无统计学意义(P>0.05)。结论 CAB移植后不会引起全身免疫反应,其引发的移植局部免疫排斥反应弱于FDAB。(本文来源于《解放军医学院学报》期刊2014年03期）
陆海波[2]（2012）在《战场严重四肢伤分级救治系列产品的研究》一文中研究指出一、目的：本研究立足于我军战时严重四肢伤分级救治的实际需要，着力研究一系列有望应用于四肢伤救治的产品和技术，具体包括新型壳聚糖急救止血剂、锁定暂时性血管分流装置、自体血凝块预混的冻干骨和凝血酶原。通过本研究，试图为上述产品的后续研发提供理论基础和实验依据。具体而言，本研究分为以下叁个方面：着眼于四肢伤的战（现）场急救阶段，我们针对现有壳聚糖急救止血剂（chitosan-based first aid hemostat, CFAH）水下粘附力差，止血效果欠佳的不足，开展了壳聚糖急救止血剂化学修饰的初步研究，并对止血剂的止血及粘附机理进行初步探索，旨在为进一步提升壳聚糖急救止血剂水浸条件下的止血效果而提供理论基础和实验依据。着眼于四肢伤的紧急救治阶段，我们针对美军目前正在使用的暂时性血管分流（temporary vascular shunt, TVS）的分流管固定费时、不牢靠，脱出率高的不足，设计了独具螺纹和配套锁定螺母的分流装置——锁定暂时性血管分流（locked temporary vascular shunt, LTVS）装置，旨在进一步提高TVS技术的救治效率和安全性。着眼于四肢伤的早期治疗阶段，我们针对大段骨缺损修复时骨不连、骨延迟愈合等难题，研究了新型异体骨填充材料——自体血凝块预混的冻干辐照异体骨（autologous coagula impregnated freeze-dried irradiated allograft bone,ACIFIAB）。同时，针对现有组织工程缓释技术存在的局部因子的高浓度与因子最佳效应浓度不一致的矛盾，提出了“原料修复策略”（material repair strategy,MRS），并研究了有望促进冻干异体骨改建的新的促成骨因子——凝血酶原（prothrombin, PT），旨在进一步改善骨移植材料的血液供应和促进成骨。二、方法：在CFAH止血机制及改性的初步探索性研究方面，我们首先尝试通过Schiff碱合成和多肽合成的方法对壳聚糖急救止血剂进行化学改性，分别合成了经3,4-二羟基苯甲醛修饰的壳聚糖（DHBH modified chitosan, DMCTS）和经左旋多巴修饰的壳聚糖（DOPAmodified chitosan, DOPAMCTS），通过傅立叶红外光谱分析、凝血试验以及扫描电镜等手段对上述两种改性的壳聚糖和几种包括甲壳素、壳聚糖、Celox止血剂、乌鱼骨等在内的止血剂进行理化表征，并通过止血及粘附效果的对比分析，进一步从物理及化学两个层面对止血剂的止血及粘附机制进行深入探讨。在LTVS装置的研究方面，我们设计了独具螺纹和配套锁定螺母的分流装置。然后通过体外血管爆破压试验评价其吻合强度；通过犬股动脉、髂总动脉损伤模型评价其吻合效率；通过组织学方法评价吻合部位血管壁组织的卡压损伤情况。在ACIFAB的研究方面，我们首先通过体外限制性压缩实验来比较和评价不同异体骨材料的力学性能，随后通过异位植骨实验及其后的HE染色、血小板内皮细胞粘附分子1（platelet endothelial cell adhesion molecule-1,PECAM-1）免疫组化染色、Masson染色以及针对VEGFα的qRT-PCR等方法来评价自体血凝块对异体骨血管化和改建的影响，并用Image-Pro Plus图像分析软件对经免疫组化染色显示的双侧植入物内血管面积及数目进行定量分析。在PT的研究方面，我们首先通过ELISA、CCK8、RT-PCR及qRT-PCR等方法体外评价凝血酶原对成骨细胞增殖及分泌BMP-2的影响。继而，通过兔双侧桡骨缺损模型和术后X线评分及缺损面积定量分析的方法评价自体凝血酶原对大段骨缺损的修复效果。随后，我们通过免疫组化的方法观察新鲜骨组织内经骨库制备技术处理后凝血酶原的变化。最后，我们制备了以壳聚糖-PLGA微球为缓释载体的复合人凝血酶原冻干辐照异体骨（humanprothrombin impregnated freeze-dried irradiated allograft bone, HPIFIAB），并通过扫描电镜观察了其表面形貌，并通过ELISA测试了其于体外对PT的缓释性能。叁、结果：1．CFAH的止血机制及改性初探傅立叶红外光谱图提示，Celox止血剂与国产水溶性壳聚糖均含有代表N-H键的伸缩振动峰；DMCTS样品的光谱图上出现了我们预期的C=N双键及苯环特征峰；在DOPAMCTS分子中，DOPA的邻苯二酚和氨基均链接到了壳聚糖的侧链上。凝血试验的结果提示，甲壳素不具备促凝作用；经修饰为DMCTS后，壳聚糖的促凝作用消失；而壳聚糖、Celox止血剂以及DOPAMCTS均具有明显的促凝作用，各组的凝血时间具有显着性差异（p=0.000）。另，未经研磨的乌鱼骨块，具备优异的促凝血性能，而经过反复研磨后的乌鱼骨粉其促凝作用消失，两组的凝血时间具有显着性差异（p=0.000）。扫描电镜结果提示，完整的乌鱼骨块表面高度整齐划一，而经研磨的乌鱼骨粉末其原有的表面形貌被破坏，与壳聚糖颗粒一样，表面则极不规则。经近乎相等的水流冲刷作用下，国产壳聚糖与乌鱼骨颗粒在横纹肌组织表面的存留情况明显不同。其中，粘附于横纹肌表面的壳聚糖颗粒在水流冲刷的作用下全部消失；乌鱼骨颗粒在水流冲刷的作用下仍然与组织牢固粘附；乌鱼骨与壳聚糖的等比例混合颗粒仅有极少数存留；先撒乌鱼骨，后撒壳聚糖的组织表面仍有较多颗粒存留。2．LTVS装置的研究体外爆破压测定的结果提示，经锁定螺母固定的血管残端其爆破压的实测值比经普通缝线结扎固定者高114.29%（p=0.000）。LTVS的吻合时间可比TVS的吻合时间缩短60.37%（p=0.000）。虽然经过丝线或塑料螺纹持续1周的卡压，吻合口处的血管壁组织（特别是血管肌层）仍然能够维持其结构的连续性。3．ACIFAB的研究异位植骨实验的大体标本提示，术后8周时，在同一只大鼠体内，实验侧植入物表面已经有大量的新生血管长入，而对照侧植入物表面未见明显的血管长入。HE染色提示，到了术后第4周和第8周，实验侧的新生血管密度明显高于对照侧。免疫组化染色提示，在术后1周，双侧均未见明显的管腔样组织被染成PECAM-1阳性，但在血凝块植入侧，可见大量的团块状物质被PECAM-1阳性识别；在术后4周和8周，在同一只宿主体内，实验侧的PECAM-1阳性染色区域明显较对照侧多，且大部分集中于管腔状结构周围。定量分析结果提示，在术后1周、4周及8周，实验侧植入物内的血管面积较对照侧相比均增大，且差异具有统计学意义（p=0.035）。Masson染色提示，在术后第1周，实验侧与对照侧的异体骨颗粒均呈散在分布，无明显基质生成，而且，实验侧视野内可见大小不一的血凝块颗粒；在术后第4周，实验侧的异体骨颗粒已被新生的基质包围并连成片状，其间分布着大量的蚯蚓状血管组织，而对照侧异体骨周围的基质连接并不完全，基本上仍呈各自分散的状态，其间并未见明显的血管状组织；在术后第8周，实验侧的基质进一步成熟，密度增加，大量的异体骨颗粒呈现溶解吸收，其间也可看到大量的蚯蚓状血管组织，而对照侧异体骨周围的基质融合也进一步增强，但程度不及实验侧，且未见大量的血管组织及明显的异体骨溶解。qRT-PCR的结果提示，在术后1周，实验侧植入物标本中VEGFα的表达明显高于对照组（p <0.05）。而到了术后第4周和第8周，双侧植入物标本中VEGFα的表达无显著性差异。体外限制性压缩实验的结果提示，新鲜冷冻骨的刚度（stiffness, S）和弹性模量（elastic modulus, EM）略高于复水后的冻干骨（p <0.05）。且经过新鲜血凝块或壳聚糖溶液预混后，冻干骨的S及EM进一步降低（p <0.05）。经过渐进式打压，各组异体骨块的压缩率（ratio of compression, RC）明显升高(p=0.000)，而各组骨块的压缩变化率（delta ratio of compression,ΔRC）明显降低(p=0.000)。相关分析的结果提示，ΔRC与打压次数(Impacts, I)呈负相关（Pearson相关系数为-0.711，p=0.000），与S呈负相关（Pearson相关系数为-0.229，p=0.000），与骨块高度（Height, H）呈正相关（Pearson相关系数为0.482，p=0.000），与EM无明显相关性（Pearson相关系数为-0.053，p=0.231）。以ΔRC为因变量的回归方程为,Δ R_i=0.0590.0004327585881334×I_i+0.0004563645521868×H_i该方程的R~2值为0.516，p=0.000。其中I_i代表打压次数；Hi代表在第i次打压前沿打压方向测量的骨块高度值。4．PT的研究4．1．PT促成骨细胞增殖CCK8结果提示，当体外无血清培养条件下分别以0μg/ml、0.1μg/ml、1μg/ml、10μg/ml、25μg/ml的浓度刺激大鼠成骨细胞时， PT对细胞的增殖表现出了不同程度的促进作用，且相比之下，1μg/ml的促进作用最明显；而相同浓度梯度的凝血酶（thrombin, TH）则对细胞的增殖表现出了不尽相同的作用：当TH的刺激浓度为0.1μg/ml时，无明显的促进或抑制作用，当TH的刺激浓度为1μg/ml时，表现出了一定程度的促进作用，但当TH的浓度高于10μg/ml时，则对成骨细胞的增殖呈现出抑制作用，且浓度越高，抑制作用越明显。PT+TH的促增殖作用在1μg/ml时达到了顶峰，而当刺激浓度继续升高时，则促进作用逐渐减弱，但并不呈现出明显的抑制作用。CCK8结果还提示，在含10%胎牛血清培养条件下，PT对大鼠成骨细胞的增殖能够起到一定的促进作用。特别是较低浓度的PT (0.014μg/ml)，能够达到最佳的促进效果。4．2．PT促成骨细胞表达及分泌BMP-2ELISA的结果提示，当以0.5μg/ml为起始浓度刺激大鼠成骨细胞时，TH促成骨细胞分泌BMP-2的高峰出现在刺激后的12h，随后开始下降；而PT的促分泌效果在24h的观察周期内始终呈上升趋势；TH+PT的促分泌趋势与TH相当，最高峰也出现在12h，且峰值较TH更高；空白对照组BMP-2的高峰出现得最早，且24h的浓度最低。ELISA的结果还提示，当TH分别以0、0.1、1、10、25μg/ml的浓度梯度刺激成骨细胞时，BMP-2的分泌高峰出现在10μg/ml；而PT刺激组的分泌高峰出现在1μg/ml；TH+PT刺激组的分泌高峰则出现在10μg/ml。经RT-PCR证实，1ug/ml的PT会促进成骨细胞对BMP-2的表达增强。qRT-PCR的结果也证实，经0.1mg/ml的PT刺激后，成骨细胞对BMP-2的表达明显增强(p=0.000)。4．3．自体PT促进骨修复兔双侧桡骨缺损修复术后的X线评分结果提示，术后1w时，自体PT修复侧（实验侧）与对照侧的评分值均为0。随着观察时间的延长，双侧的骨缺损都有渐进性的修复，表现在X线评分则为分值逐渐增加。而且，自术后4w始，实验侧的分值明显高于对照侧分值（p=0.021）。图像分析的结果提示，在术后1w、4w、8w及16w，实验侧缺损面积均小于对照侧，以术后8w最明显，且差异具有显着性意义（p=0.045）。4．4．骨库制备技术对骨组织中PT的破坏经大鼠凝血酶原免疫组化染色证实，新鲜皮质骨中存在有大量的PT，且大部分与骨细胞一起位于骨陷窝内。而对比发现，经脱脂、脱蛋白、冻干及辐照等处理后，皮质骨内的骨细胞基本上被彻底清除干净，遗留下许多空泡状的陷窝；而与此同时，原本存在于新鲜异体骨中的PT也被清除干净。4．5．HPIFIAB扫描电镜的结果提示，在冻干异体骨的髓腔面，可清晰看到髓腔壁的骨小梁结构，而在皮质面，则能清晰看到皮质骨表面的滋养孔。在经壳聚糖包被冻干异体骨的髓腔面及皮质面，上述骨组织表面的正常结构被均匀的壳聚糖膜覆盖。经冻干并烘烤后的人PT-PLGA微球，其外形呈表面多孔的圆饼状，直径约为100μm，厚度约为40μm。HPIFIAB髓腔面及皮质面，分布着大小不一的微球，微球直径约为2～10μm。与单纯凝血酶原微球的多孔状表面不同，负载于冻干异体骨的微球其表面尚包裹一层光滑的壳聚糖膜。通过ELISA测定出微球的包封率为74.93%，而且在体外测出了经单纯壳聚糖以及壳聚糖-PLGA微球缓释的PT浓度曲线。从曲线上各个时间点两组的PT浓度值可见，以单纯壳聚糖为缓释载体，其溶液中释放出来的PT浓度较以壳聚糖-PLGA微球为高，且各时间点的浓度均值及标准差起伏较大。相比较而言，经壳聚糖-PLGA微球缓释后，各时间点溶液中PT的浓度均较低，且起伏波动不大，各时间点的浓度标准差也较小。从整体观察周期来看，以单纯壳聚糖为缓释载体的溶液在缓释第一天内出现了“突释”现象，PT的浓度在第一天达到了峰值，而在随后的观察周期内，虽有起伏，但PT浓度整体呈下降趋势；而以壳聚糖-PLGA微球为缓释载体的溶液则看不到对PT的“突释”，在长达30天的观察周期内，PT浓度始终维持平稳，没有出现明显的突释现象。四、结论：1．CFAH的止血机制及改性初探1．1．Schiff碱合成方案与多肽合成方案均能成功地将邻苯二酚结构桥接至壳聚糖，使壳聚糖在化学层面具备了像贝壳一样发生水下粘附的物质基础。1．2．与Schiff碱合成方案相比，多肽合成方案能够在化学修饰壳聚糖的同时保留壳聚糖的止血作用，因而更适合于本项目的后续研究。1．3．游离氨基对于壳聚糖止血剂的止血性能而言，发挥着“不可或缺”的关键作用。1．4．止血剂微观表面形貌的高度一致性，是其具备粘附特性的必备条件之一。2． LTVS装置的研究2．1．与美军现有的TVS相比，LTVS的吻合时间可以缩短60.37%。2．2．与美军现有的TVS相比，LTVS的吻合强度至少可以提高114.29%。3． ACIFIAB的研究3．1．冻干辐照异体骨比新鲜冷冻异体骨软，更容易被打压。3．2．就骨块的瞬时形变率而言，冻干辐照异体骨与新鲜冷冻异体骨不分伯仲，有望为髋臼假体提供相似的初期稳定性。3．3．由于新鲜血凝块尚能促进冻干辐照异体骨的再血管化与骨改建，我们推荐在髋臼翻修时，将冻干异体骨和自体新鲜血凝块预混后一并植入。4． PT的研究4．1．PT可以促进成骨细胞的增殖及对BMP-2的分泌。4．2．与TH不同，高浓度的PT对成骨细胞的增殖没有明显的抑制作用。4．3．局部补充自体PT可以有效促进大段骨缺损的修复。4．4．现有的骨库技术对骨组织中的PT破坏严重。4．5．借助于缓释技术，PT有望成为一种新型的促成骨因子应用于临床。总之，对壳聚糖急救止血剂止血机制与改性的初步研究，从物理化学双重层面揭示了止血剂的止血和粘附机制，有望在此基础之上进一步研发兼具止血和粘附性能的优秀止血剂；锁定暂时性血管分流装置，能够缩短吻合时间，增强吻合强度，并进一步提高分流管的抗凝特性，有望进一步提高暂时性血管分流技术的救治效率和安全性；自体血凝块预混的冻干异体骨和凝血酶原，能够进一步改善骨移植材料的血液供应和促进成骨，有望应用于大段骨缺损的治疗。因此，有必要对上述产品和技术开展后续研发，从而进一步提升我军对战时严重四肢伤的整体救治水平。(本文来源于《中国人民解放军军医进修学院》期刊2012-05-29）
荆小伟[3]（2010）在《复合环孢素A的同种异体骨与冻干骨、同系骨骨诱导性及免疫原性的比较》一文中研究指出研究背景长期以来,临床上的骨缺损修复,特别是大段骨缺损的修复,一直是外科医生面临的难题之一。解决方法主要有骨移植术及骨痂延长术。其中用于骨移植的材料主要有自体骨、同种异体骨、异种骨及人工骨四类。自体骨骨生成能力强、无免疫排斥等优点,但在骨缺损治疗过程中,自体骨具有明显的局限性和并发症,如来源有限、对供区有损伤、机会感染等,这些不利因素限制了其在临床上的应用；人工骨虽然传导性较好但骨诱导性较差、缺乏孔隙、颗粒较小、易分解、脆性大不耐压且相对缺乏生物活性等缺点,限制了它的应用。而同种异体骨自1880年Macewe做了人类历史上首例同种异体骨移植术,1908年Lexer最早实施了膝关节肿瘤切除后的同种异体骨移植术,1915年Albee出版了《骨移植外科》以来,同种异体骨移植逐渐成为骨科治疗的重要手段,它取材方便,数量形状不受限制,对已被破坏的骨折周围的内环境,有着恢复迅速、改善和重建血循环快捷并且其成骨性能及力学性能优于人工骨,而来源也不像自体骨那样受到限制等,诸多独特的优势和应用价值,进而使得同种异体骨在临床上应用广泛,逐渐成为骨科治疗的重要手段。但也存在一些目前难以彻底解决的问题,如免疫排斥、晚期感染、移植骨愈合缓慢等,同种异体骨移植愈合受它的生物机制和免疫机制两大原则支配,而免疫排斥反应是它的关键；免疫排斥反应的主要表现为异体骨周围炎症细胞浸润,再生血管变性闭塞,造成骨诱导和骨传导作用下降及广泛的骨吸收,引起骨延迟愈合、不愈合、骨质疏松、骨折等；异体骨是异体生物性材料,具有一定的免疫抗原性,免疫排斥反应是制约异体骨移植的主要因素。降低异体骨移植的免疫排斥反应是提高治疗效果和决定异体植骨成功与否的关键。早期异体骨移植的最大问题是疾病传播与免疫排斥反应,而移植排斥反应仍是导致新鲜同种异体骨移植失败的最主要原因。机体的免疫系统对于植入体内的非已成分(同种异体骨)会产生一系列免疫应答的防御行为,其中包括炎症反应、抗体产生、补体活化及各种细胞因子的表达等,因此在生物材料和医疗器械的生物学评价中引入免疫学评价的内容将对减小人体应用的风险提供必要的科学依据,同种异体骨是骨科最常用的骨植入材料之一,同时异体骨的免疫原性与异体骨移植修复骨缺损的临床效果密切相关。早些时候人们曾尝试着用柳硫汞等化学方法的处理来降低异体骨的免疫原性和对其进行灭菌,但效果不佳。随着制备工艺的改进,人们逐渐倾向于用深低温冷冻法、冷冻干燥法及丫射线辐照来降低异体骨的免疫原性,其中丫射线辐照更兼具强大的灭菌功效。经过世界各国骨库几十年来的实践证明,上述方法能够很好地降低异体骨的免疫原性并有效地降低了因骨移植所致的疾病传播的风险,因而是目前最为常用的同种异体骨的制备方法。然而严格地讲,上述方法并不能完全消除同种异体骨的免疫原性,而经过上述方法处理后,同种异体骨的成骨性能及生物力学性能受到了明显的损害。致使目前为止临床上应用异体骨修复骨缺损的效果,特别是修复大段骨缺损的效果仍不能够令人满意。鉴于此本课题组对同种异体骨的制备方法进行新的探索。具体而言,就是在制备同种异体骨的过程中复合环孢菌素,通过在局部发挥环孢菌素强大的免疫抑制作用来代替深低温冷冻、冷冻干燥及γ射线辐照的降免疫原性作用,并用低温等离子体技术来代替γ射线辐照对异体骨进行灭菌,以期更好地抑制异体骨移植的免疫排斥反应,同时减轻制备过程中对异体骨成骨性能及力学性能的损害。另外,我们希望通过环孢菌素的局部应用来降低其药物副反应。研究目的为了进一步减轻同种异体骨的免疫原性,同时又不损害异体骨的机械强度,裴国献、陆海波等人采用新的方法制备了复合环孢素A的同种异体骨,并申请到了发明专利。在同种异体骨治疗大段骨缺损方面进行了有益的探索。但复合环孢素同种异体骨在制备过程中需要对供骨进行脱脂脱蛋白,一定程度上减轻了其免疫原性,但同时也造成了对同种异体骨生物学特性起重要作用的BMP及其他生物活性成分的大量丢失。因此有必要对其免疫原性及骨诱导性进行评估,通过对复合环孢素A并低温等离子体灭菌这一新的异体骨制备方法制备的同种异体骨与冻干同种异体骨及同系骨骨诱导性及免疫原性的比较,探讨复合环孢素A的同种异体骨在临床上应用的可能性。研究方法1、淋巴细胞二次刺激实验Alamarblue法和MTT法的选择取Balb/c小鼠脾脏淋巴细胞,将分离得到的细胞原液稀释成浓度分别为2×105、1×105、0.5×105、0.25×105、0.125×105、0.0625×105cell／ml的细胞悬液。在96孔培养板上添加不同浓度细胞悬液200μl,重复6孔,并设置调零孔。Alamarblue法：铺板后每孔加入20μlAlamarblue。分别于培养0、2、4、6、20h后,用酶标仪在570nm(主波长)及600nm(参考波长)检测各个孔的吸光度值。按照说明书通过公式计算出Alamarblue的还原率。MTT法：细胞种板设计同AlamarBlue法。每空加入MTT20μl。培养4小时后,DMSO显色后,在490nm(主波长)及630nm(参考波长)检测各个孔的吸光度值。对Alamarblue法与MTT法、Alamarblue法与时间进行相关性分析。精密度测定：组内差异用变异系数CV表示。CV=组内各数据的标准差(s)／组内各数据的平均值(x)。2、复合环孢素A的同种异体骨与冻干同种异体骨及同系骨骨诱导性及免疫原性的比较复合环孢素A的同种异体骨的制备：取C57小鼠的髂骨,制成骨粒,脱脂脱蛋白后采用固体分散法复合复合环孢素A,然后采用低温等离子体灭菌。冻干同种异体骨的制备：取C57小鼠的髂骨,制成骨粒,采用蒸馏水反复冲洗,在低温冷冻干燥机中冻干,采用γ射线辐照灭菌。同系骨的制备：术中取Balb/c小鼠的髂骨,制成骨粒,生理盐水反复冲洗。骨匀浆上清的制备：取C57小鼠及Balb/c小鼠的四肢骨骼蒸馏水反复冲洗,干燥后研磨成骨粉与细胞培养液混合制成骨粉悬液,在超净台中,经无菌滤器过滤,制得骨匀浆上清。将制成的骨粒植入Balb/c小鼠左侧股直肌内制成股直肌袋模型。分别在2、4、6、8w时取材,进行MASSON染色并进行碱性磷酸酶的检测。在4w时取各组小鼠脾脏,分离淋巴细胞,制成一定浓度的细胞悬液,加入对应的骨匀浆上清及Alamarblue指示剂,用酶标仪在570nm(主波长)及600hm(参考波长)检测各个孔的吸光度值。计算出各组的刺激指数。3、用SPSS13.0对结果进行数据分析,实验结果采用x±s表示,多个样本均数比较采用析因设计方差分析的方法,单独比较采用one-way A N 0 V A或t检验分析方法。当p<0.05时,差异有统计学意义。结果1、淋巴细胞二次刺激实验Alamarblue法和MTT法的选择细胞浓度在0.0625×105～2×105cell／ml之间时,0h(P>0.05)细胞浓度与还原率之间的相关关系不明显。2h(P<0.05)、4h(P<0.001)、6h(P<0.001)、20h(P<0.001)细胞浓度与还原率之间有显着的相关性。不同的细胞浓度随着培养时间的延长,还原率也随之增加。最大细胞浓度20h的还原率仍未达100%。Alamarblue法测得的还原率及MTT法测得的OD值均随着细胞浓度的增大而增加。对二者进行相关性分析,相关系数r=0.998,P<0.05。两种方法存在正线性相关关系,且相关关系密切。细胞浓度为2×105时CV (Alamarblue)=0.0152, CV(MTT)=0.0487;细胞浓度为0625×105时CV (Alamarblue)=0.023, CV(MTT)=0.0369。2复合环孢素A的同种异体骨与冻干同种异体骨及同系骨骨诱导性及免疫原性的比较2.1淋巴细胞二次刺激实验采用完全随机设计资料的方差分析分别对两个时间点叁组淋巴细胞刺激指数进行分析。2w时,处理组间F=0.3228,P=0.7302>0.05,叁组之间差异不显着。4w时,处理组间F=253.6085,P<0.001。叁组间差异显着。叁组间异质性进一步采用Bonferroni检验,复合环孢素A组与同系组差异不显着,冻干组与复合环孢素A组及同系组差异显着,冻干组淋巴细胞刺激指数较高。2.2局部碱性磷酸酶检测对4个时间点3组碱性磷酸酶数据进行两因素析因分析后发现,叁组(F组间=25.1807；P<0.001)及各个时间点(F时间=239.5745；P<0.001)均存在统计学差异。进一步采用单向方差分析(one-way ANOVA)进行多样本均数间的比较发现,符合环孢素A组在2、4、6,8w的碱性磷酸酶含量统计学差异显着(F=76.9263,P<0.001)。同系组在2、4、6、8w的碱性磷酸酶含量统计学差异显着(F=60.7506,P<0.001)。冻干骨组在2,4,6,8 w的碱性磷酸酶含量统计学差异显着(F=132.4105,P<0.001)。2 w时叁组间的碱性磷酸酶含量统计学差异不显着(F=10.5117,P<0.05).4 w时冻干组与复合环孢素A组、同系组间统计学差异显着,复合环孢素A组与同系组间差异不显着(F=0.0418,P<0.05)。6 w时冻干组与复合环孢素A组、同系组间统计学差异显着,复合环孢素A组与同系组间差异不显着(F=9.0822,P<0.05)。8 w时冻干组与复合环孢素A组、同系组间统计学差异显着,复合环孢素A组与同系组间差异不显着(F=5.7737,P<0.05)。2.3局部组织学检测通过MASSON染色,2、4、6、8w时,复合环孢素组与同系组的成成骨量均比冻干组高。叁组在各个时间点植入骨粒周围均未发现炎症反应。结论1、淋巴细胞二次刺激实验Alamarblue法和MTT法的选择在本研究中检测了不同浓度的BALB/C小鼠脾淋巴细胞在加入Alamarblue后不同时间所测得的吸光度值,并计算出相对应的还原率。并对加入指示剂4h后Alamarblue的还原率及MTT的OD值进行相关性分析。在加入Alamarblue后,不同细胞浓度的还原率随着作用时间的延长而增加,当细胞浓度为2×105cell/ml,作用20h后还原率为78.3%,仍未达到100%。不同的细胞浓度在作用时间为0h(P>0.05)条件下不同细胞浓度与还原率之间的线性相关关系不明显,2h(P<0.05)、4h(P<0.001)、6h(P<0.001)、20h(P<0.001)条件下不同细胞浓度与还原率之间正性线性相关关系明显。说明在细胞浓度在0.0625×105-2×105cell/ml时,加入Alamarblue后4、6、20h所得出的还原率均可间接反应出细胞数量,从而在使用小鼠脾细胞进行细胞增殖或细胞毒试验中反映细胞存活的情况。如果进行细胞增殖实验则推荐接种细胞密度为0.0625×105-0.5×105cell/ml,作用时间为4-6h。较高的细胞密度和较长的作用时间可能使所有检测的样本还原态的Alamarblue达到饱和状态。如果进行细胞毒性实验,则可采用本研究的细胞接种浓度及培养时间。Alamarblue法与MTT法的结果高度相关。在高浓度时Alamarblue法与MTT法组内差异接近,均小于2%。低浓度时Alamarblue法与MTT法组内差异接近,均小于2%。说明在高浓度、低浓度时Alamarblue法与传统的MTT法相比稳性及重复性并无明显差异。2复合环孢素A的同种异体骨与冻干同种异体骨及同系骨骨诱导性及免疫原性的比较实验结果表明,术后2w,叁组间碱性磷酸酶含量统计学上有显着差异。环孢素组与同系组的碱性磷酸酶含量比冻干组高,环孢素组与同系组含量差异不明显。组织学显示叁组植入骨粒周围均没有显着的炎症细胞浸润。同系组植入骨粒骨小梁开始被吸收,条里变得模糊,冻干骨组植入骨粒骨小梁未被吸收,复合环孢素组植入骨粒的周围骨小梁开始被吸收。术后4w,叁组间碱性磷酸酶含量统计学上有显着差异,复合环孢素组与同系组含量差异不明显。复合环孢素组与同系组的碱性磷酸酶含量比冻干组高。组织学表明同系组与复合环孢素组植入骨粒已经被吸收,可见大片新生的绿染的Ⅱ型胶原纤维,分布较均匀。冻干骨植入骨粒骨小梁大部分被吸收,新生胶原纤维较同系组及复合环孢素组少,主要以结缔纤维组织为主。术后6w,叁组间碱性磷酸酶含量统计学上有显着差异。环孢素组与同系组的碱性磷酸酶含量比冻干组高,环孢素组与同系组含量差异不明显。组织学6w时,叁组植入骨粒周围均没有炎症细胞浸润。环孢素组及同系组开始出现软骨内成骨,可见骨陷窝,及骨细胞。骨粒周围开始出现红染的胶原纤维,有层次感。冻干骨骨可见植入骨粒内出现新生的胶原纤维,排列杂乱。8w时叁组间碱性磷酸酶含量统计学上有显着差异。环孢素组与同系组的碱性磷酸酶含量比冻干组高,环孢素组与同系组含量差异不明显。组织学8w时,同系组及复合环孢素组出现大片的红染的成熟胶原纤维,呈现板层排列,部分样本中间出现空腔,并含有髓腔内容物.冻干骨组可见成熟胶原纤维与新生胶原纤维交错分布,呈现红绿相间染色。2w时各个组的淋巴细胞刺激指数叁组间统计学差异不显着,4w叁组间淋巴细胞刺激指数差异显着,同系组、复合环孢素组均低于冻干组,同系组与复合环孢素之间无显着差异。可见复合在移植骨粒上的环孢素并低温等离子体灭菌,在局部抑制了T细胞的活化,为新骨的生成创造了良好的环境,避免长期全身应用环孢素所带来的副反应,同时减轻了力学方面的损害,有可能成为一种新的临床上治疗骨缺损的植骨材料。(本文来源于《南方医科大学》期刊2010-03-20）
张大伟,裴国献,荆小伟,张长成[4]（2010）在《复合环孢菌素同种异体骨与冻干同种异体骨修复兔桡骨缺损效果比较》一文中研究指出目的对比研究复合环孢菌素同种异体骨(CAB)与冻干同种异体骨(FDAB)修复兔桡骨缺损效果。方法30只新西兰大白兔,随机分为材料提供组、实验组、对照组3组,每组10只。取材料提供组双侧髂骨制备CAB及FDAB。制备兔右侧桡骨中段10mm的骨与骨膜缺损,实验组植入CAB修复,对照组植入FDAB修复。术后4、12周每组各处死5只动物,进行大体标本、X线片和组织学观察。结果术后4周,实验组X线片评分高于对照组(P=0.001),缺损区新骨形成量及异体骨与受体骨融合性均高于对照组;术后12周,实验组X线片评分高于对照组(P=0.001),缺损区骨塑形效果优于对照组。结论CAB修复兔桡骨缺损效果优于FDAB,是否为局部免疫反应状态的不同造成这种差异需进一步探讨。(本文来源于《南方医科大学学报》期刊2010年02期）
张远鹰,王文军,王金成,左建林[5]（2009）在《骨髓基质细胞复合冻干异体骨成骨的实验研究》一文中研究指出在游离骨移植中,自体骨移植的融合效果最好,但其存在供骨区的损伤如另做切口、疼痛、感染以及取骨量的限制和供骨区解剖学形态的改变等缺点。为了克服这些缺点,本实验进行复合自体红骨髓和骨髓基质细胞的冻干骨修复骨缺损的实验研究。1材料与方法1.1骨髓的抽吸及单核细(本文来源于《中国实验诊断学》期刊2009年10期）
李明东,金丹,裴国献,奚庭斐[6]（2009）在《冻干同种异体骨的免疫原性评价及免疫实验动物模型的选择》一文中研究指出目的观察冻干同种异体骨材料对人、Balb/c小鼠、C57小鼠及新西兰兔淋巴细胞转化的影响,探讨冻干同种异体骨材料的免疫原性及其体外检测方法;分析何种动物更适合做免疫相关实验研究。方法人淋巴细胞来源于10名健康青年志愿者外周静脉血,Balb/c、C57小鼠的淋巴细胞为其脾脏(本文来源于《第七届全国创伤学术会议暨2009海峡两岸创伤医学论坛论文汇编》期刊2009-09-25）
熊卉,张伟,邓益辉[7]（2006）在《脱钙冻干异体骨移植对骨缺损的修复作用》一文中研究指出目的应用脱钙冻干异体骨(DFDBA)修复骨缺损,解决种植区的骨量不足问题。方法在种植外科中,将脱钙冻干异体骨用于19例种植区骨缺损患者,观察种植体动度、牙齿指数(GI)及X线改变等临床指标,评价其临床应用效果。结果19例植骨手术均获成功,无一例种植体周围炎发生,种植体初期稳定性良好。结论脱钙冻干异体骨既有一定的力学支持能力,又有骨诱导作用,且可塑性强。(本文来源于《中华实验外科杂志》期刊2006年12期）
周勇刚,王岩[8]（2006）在《采用解剖型假体及冻干异体骨进行股骨打压植骨翻修的经验》一文中研究指出[背景]在人工髋关节置换术后假体松动需要进行翻修时,势必会伴有不同程度的骨缺损。而对严重骨缺损患者,采用骨水泥充填骨缺损已经被大多数人所摒弃。股骨部分采用全多孔涂层假体可以取得较好的效果,但是对股骨近端的骨缺损并没有进行重建,甚至还有应力遮挡造成的进一步骨丢失,而由 Gie 提出的股骨侧嵌压植骨技术为严重骨缺损提供了一种很好的解决方法,病理检查证明植骨可以与宿主骨整合,达到了骨重建的目的,尤其对 PaproskyⅢB型和 PaproskyⅣ型更有其无可替代的地位。而 Gie 经典的手术是采用 Exter 假体和深冻骨进行打压植骨,但是确面临着假体下沉的问题,我们采用解剖型假体及冻干异体骨进行股骨打压植骨也取得了很好的效果,并且无假体下沉。[目的]通过观察我院采用解剖型假体及冻干异体骨进行股骨打压植骨重建骨缺损的效果,确证采用解剖型假体及冻干异体骨进行股骨打压植骨的可行性。[方法]我院从2001年开始在国内率先开展打压植骨技术以来采用 SPⅡ解剖型假体及冻干异体骨共进行了37例股骨打压植骨翻修手术,均获得了平均31个月(5～46个月)的随访。患者平均63.7岁(28～74岁)。男性25例,女性12例。因为无菌性松动而翻修的病例31例,因术后感染二期翻修的病例6例。PaproskyⅡ型缺损2 例、PaproskyⅢA型缺损16例、PaproskyⅢB型缺损15例、PaproskyⅣ型缺损4例。通过 X 线片上观察术后及随访时假体的位置是否有改变,假体与移植骨、移植骨与宿主骨之间是否有透光线,通过 Harris 评分进行功能评分并且观察并发症的发生情况。[结果]术后患者均无明显疼痛。Harris 评分从术前平均为44.6分(21～56分)提高到术后,术后平均为87.4分 (76～96分)。股骨假体固定牢固,没有下沉。出现股骨术中骨折3例,脱位1例。[结论]采用解剖型假体及冻干异体骨进行股骨打压植骨重建股骨骨缺损的临床效果满意,并且有假体下沉率低、通过异体骨传播疾病的可能性低、异体骨易于保存等优点,不失为一种非常好的股骨翻修方法。(本文来源于《全国骨科临床研究新进展研讨会暨学习班论文集》期刊2006-06-01）
张磊涛,南欣荣,黄洪章[9]（2005）在《bFGF复合部分脱矿冻干辐照异体骨修复兔下颌骨缺损的实验研究》一文中研究指出目的:探讨bFGF(basic fibroblast growth factor,碱性成纤维细胞生长因子)复合部分脱矿冻干辐照异体骨在修复下颌骨缺损中的应用,研究bFGF 在骨缺损修复中的成骨作用机制及其适宜载体的选择。方法取健康成年家兔新鲜下颌骨,经部分脱矿和冻干辐照处理以降低其免疫原性。在21例兔双侧下颌骨缺损模型中,按照完全随机原则,一侧选用bFGF 复合部分脱矿冻干辐照异体骨修复骨缺损,作为实验组;另一侧单纯以部分脱矿冻干辐照异体骨修复,作为对照组。术后3、6、12周分别处死7只实验动物,对标本进行大体观察、X 线摄片观察、组织学病理切片镜下观察及电镜观察。依据Lane-Sandhu x 线评分标准和Lane-Sandhu 组织学评分法,对X 线摄片观察结果和组织学病理切片镜下观察结果进行量化和统计学处理。结果实验组和对照组手术创口均为一期愈合,宿主对移植物未发生排斥反应。术后不同时期,实验组新生血管的量、新生纤维组织及纤维母细胞、类骨质等均较对照组多。经对X 线照片和病理切片进行评分,并对评分数据统计分析,实验组和对照组评分结果有显着性差异(P<0.01)。扫描电镜显示,实验组植骨区有大量新生骨,随时间推移,新骨的量渐多;对照组植骨区多为纤维组织.新骨形成少。结论bFGF 可促进异体骨植骨区骨质形成。部分脱矿冻干辐照异体骨可用于下颌骨缺损的修复并可作为bFGF 的载体。(本文来源于《第四届中国国际暨第七次全国口腔颌面外科学术会议论文集》期刊2005-10-01）
刘玉增,李琪文,王继芳[10]（2005）在《冻干同种异体骨与冻干异种骨移植治疗骨缺损的比较实验研究》一文中研究指出目的:对比观察冻干同种异体骨和冻干异种骨骨移植治疗骨缺损的效果。方法:48只中国大白兔一侧桡骨造成1cm骨缺损,随机分为同种异体骨组和异种骨组,每组24只,分别植入两种移植骨,术后4、8、12周分批取材,进行X线片和组织学检查,然后做对比分析。结果:术后4周异种骨组的X线片,GaryX线评分与同种异体骨组有统计学差异,而术后8周同种异体骨组组织学检查以及组织学评分与异种骨组有统计学差异,在其他时期两组比较无统计学差异。结论:冻干异种骨具有很好的成骨效果,可以作为修复骨缺损的移植材料。(本文来源于《中国骨伤》期刊2005年05期）
冻干异体骨论文开题报告
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
一、目的：本研究立足于我军战时严重四肢伤分级救治的实际需要，着力研究一系列有望应用于四肢伤救治的产品和技术，具体包括新型壳聚糖急救止血剂、锁定暂时性血管分流装置、自体血凝块预混的冻干骨和凝血酶原。通过本研究，试图为上述产品的后续研发提供理论基础和实验依据。具体而言，本研究分为以下叁个方面：着眼于四肢伤的战（现）场急救阶段，我们针对现有壳聚糖急救止血剂（chitosan-based first aid hemostat, CFAH）水下粘附力差，止血效果欠佳的不足，开展了壳聚糖急救止血剂化学修饰的初步研究，并对止血剂的止血及粘附机理进行初步探索，旨在为进一步提升壳聚糖急救止血剂水浸条件下的止血效果而提供理论基础和实验依据。着眼于四肢伤的紧急救治阶段，我们针对美军目前正在使用的暂时性血管分流（temporary vascular shunt, TVS）的分流管固定费时、不牢靠，脱出率高的不足，设计了独具螺纹和配套锁定螺母的分流装置——锁定暂时性血管分流（locked temporary vascular shunt, LTVS）装置，旨在进一步提高TVS技术的救治效率和安全性。着眼于四肢伤的早期治疗阶段，我们针对大段骨缺损修复时骨不连、骨延迟愈合等难题，研究了新型异体骨填充材料——自体血凝块预混的冻干辐照异体骨（autologous coagula impregnated freeze-dried irradiated allograft bone,ACIFIAB）。同时，针对现有组织工程缓释技术存在的局部因子的高浓度与因子最佳效应浓度不一致的矛盾，提出了“原料修复策略”（material repair strategy,MRS），并研究了有望促进冻干异体骨改建的新的促成骨因子——凝血酶原（prothrombin, PT），旨在进一步改善骨移植材料的血液供应和促进成骨。二、方法：在CFAH止血机制及改性的初步探索性研究方面，我们首先尝试通过Schiff碱合成和多肽合成的方法对壳聚糖急救止血剂进行化学改性，分别合成了经3,4-二羟基苯甲醛修饰的壳聚糖（DHBH modified chitosan, DMCTS）和经左旋多巴修饰的壳聚糖（DOPAmodified chitosan, DOPAMCTS），通过傅立叶红外光谱分析、凝血试验以及扫描电镜等手段对上述两种改性的壳聚糖和几种包括甲壳素、壳聚糖、Celox止血剂、乌鱼骨等在内的止血剂进行理化表征，并通过止血及粘附效果的对比分析，进一步从物理及化学两个层面对止血剂的止血及粘附机制进行深入探讨。在LTVS装置的研究方面，我们设计了独具螺纹和配套锁定螺母的分流装置。然后通过体外血管爆破压试验评价其吻合强度；通过犬股动脉、髂总动脉损伤模型评价其吻合效率；通过组织学方法评价吻合部位血管壁组织的卡压损伤情况。在ACIFAB的研究方面，我们首先通过体外限制性压缩实验来比较和评价不同异体骨材料的力学性能，随后通过异位植骨实验及其后的HE染色、血小板内皮细胞粘附分子1（platelet endothelial cell adhesion molecule-1,PECAM-1）免疫组化染色、Masson染色以及针对VEGFα的qRT-PCR等方法来评价自体血凝块对异体骨血管化和改建的影响，并用Image-Pro Plus图像分析软件对经免疫组化染色显示的双侧植入物内血管面积及数目进行定量分析。在PT的研究方面，我们首先通过ELISA、CCK8、RT-PCR及qRT-PCR等方法体外评价凝血酶原对成骨细胞增殖及分泌BMP-2的影响。继而，通过兔双侧桡骨缺损模型和术后X线评分及缺损面积定量分析的方法评价自体凝血酶原对大段骨缺损的修复效果。随后，我们通过免疫组化的方法观察新鲜骨组织内经骨库制备技术处理后凝血酶原的变化。最后，我们制备了以壳聚糖-PLGA微球为缓释载体的复合人凝血酶原冻干辐照异体骨（humanprothrombin impregnated freeze-dried irradiated allograft bone, HPIFIAB），并通过扫描电镜观察了其表面形貌，并通过ELISA测试了其于体外对PT的缓释性能。叁、结果：1．CFAH的止血机制及改性初探傅立叶红外光谱图提示，Celox止血剂与国产水溶性壳聚糖均含有代表N-H键的伸缩振动峰；DMCTS样品的光谱图上出现了我们预期的C=N双键及苯环特征峰；在DOPAMCTS分子中，DOPA的邻苯二酚和氨基均链接到了壳聚糖的侧链上。凝血试验的结果提示，甲壳素不具备促凝作用；经修饰为DMCTS后，壳聚糖的促凝作用消失；而壳聚糖、Celox止血剂以及DOPAMCTS均具有明显的促凝作用，各组的凝血时间具有显着性差异（p=0.000）。另，未经研磨的乌鱼骨块，具备优异的促凝血性能，而经过反复研磨后的乌鱼骨粉其促凝作用消失，两组的凝血时间具有显着性差异（p=0.000）。扫描电镜结果提示，完整的乌鱼骨块表面高度整齐划一，而经研磨的乌鱼骨粉末其原有的表面形貌被破坏，与壳聚糖颗粒一样，表面则极不规则。经近乎相等的水流冲刷作用下，国产壳聚糖与乌鱼骨颗粒在横纹肌组织表面的存留情况明显不同。其中，粘附于横纹肌表面的壳聚糖颗粒在水流冲刷的作用下全部消失；乌鱼骨颗粒在水流冲刷的作用下仍然与组织牢固粘附；乌鱼骨与壳聚糖的等比例混合颗粒仅有极少数存留；先撒乌鱼骨，后撒壳聚糖的组织表面仍有较多颗粒存留。2．LTVS装置的研究体外爆破压测定的结果提示，经锁定螺母固定的血管残端其爆破压的实测值比经普通缝线结扎固定者高114.29%（p=0.000）。LTVS的吻合时间可比TVS的吻合时间缩短60.37%（p=0.000）。虽然经过丝线或塑料螺纹持续1周的卡压，吻合口处的血管壁组织（特别是血管肌层）仍然能够维持其结构的连续性。3．ACIFAB的研究异位植骨实验的大体标本提示，术后8周时，在同一只大鼠体内，实验侧植入物表面已经有大量的新生血管长入，而对照侧植入物表面未见明显的血管长入。HE染色提示，到了术后第4周和第8周，实验侧的新生血管密度明显高于对照侧。免疫组化染色提示，在术后1周，双侧均未见明显的管腔样组织被染成PECAM-1阳性，但在血凝块植入侧，可见大量的团块状物质被PECAM-1阳性识别；在术后4周和8周，在同一只宿主体内，实验侧的PECAM-1阳性染色区域明显较对照侧多，且大部分集中于管腔状结构周围。定量分析结果提示，在术后1周、4周及8周，实验侧植入物内的血管面积较对照侧相比均增大，且差异具有统计学意义（p=0.035）。Masson染色提示，在术后第1周，实验侧与对照侧的异体骨颗粒均呈散在分布，无明显基质生成，而且，实验侧视野内可见大小不一的血凝块颗粒；在术后第4周，实验侧的异体骨颗粒已被新生的基质包围并连成片状，其间分布着大量的蚯蚓状血管组织，而对照侧异体骨周围的基质连接并不完全，基本上仍呈各自分散的状态，其间并未见明显的血管状组织；在术后第8周，实验侧的基质进一步成熟，密度增加，大量的异体骨颗粒呈现溶解吸收，其间也可看到大量的蚯蚓状血管组织，而对照侧异体骨周围的基质融合也进一步增强，但程度不及实验侧，且未见大量的血管组织及明显的异体骨溶解。qRT-PCR的结果提示，在术后1周，实验侧植入物标本中VEGFα的表达明显高于对照组（p <0.05）。而到了术后第4周和第8周，双侧植入物标本中VEGFα的表达无显著性差异。体外限制性压缩实验的结果提示，新鲜冷冻骨的刚度（stiffness, S）和弹性模量（elastic modulus, EM）略高于复水后的冻干骨（p <0.05）。且经过新鲜血凝块或壳聚糖溶液预混后，冻干骨的S及EM进一步降低（p <0.05）。经过渐进式打压，各组异体骨块的压缩率（ratio of compression, RC）明显升高(p=0.000)，而各组骨块的压缩变化率（delta ratio of compression,ΔRC）明显降低(p=0.000)。相关分析的结果提示，ΔRC与打压次数(Impacts, I)呈负相关（Pearson相关系数为-0.711，p=0.000），与S呈负相关（Pearson相关系数为-0.229，p=0.000），与骨块高度（Height, H）呈正相关（Pearson相关系数为0.482，p=0.000），与EM无明显相关性（Pearson相关系数为-0.053，p=0.231）。以ΔRC为因变量的回归方程为,Δ R_i=0.0590.0004327585881334×I_i+0.0004563645521868×H_i该方程的R~2值为0.516，p=0.000。其中I_i代表打压次数；Hi代表在第i次打压前沿打压方向测量的骨块高度值。4．PT的研究4．1．PT促成骨细胞增殖CCK8结果提示，当体外无血清培养条件下分别以0μg/ml、0.1μg/ml、1μg/ml、10μg/ml、25μg/ml的浓度刺激大鼠成骨细胞时， PT对细胞的增殖表现出了不同程度的促进作用，且相比之下，1μg/ml的促进作用最明显；而相同浓度梯度的凝血酶（thrombin, TH）则对细胞的增殖表现出了不尽相同的作用：当TH的刺激浓度为0.1μg/ml时，无明显的促进或抑制作用，当TH的刺激浓度为1μg/ml时，表现出了一定程度的促进作用，但当TH的浓度高于10μg/ml时，则对成骨细胞的增殖呈现出抑制作用，且浓度越高，抑制作用越明显。PT+TH的促增殖作用在1μg/ml时达到了顶峰，而当刺激浓度继续升高时，则促进作用逐渐减弱，但并不呈现出明显的抑制作用。CCK8结果还提示，在含10%胎牛血清培养条件下，PT对大鼠成骨细胞的增殖能够起到一定的促进作用。特别是较低浓度的PT (0.014μg/ml)，能够达到最佳的促进效果。4．2．PT促成骨细胞表达及分泌BMP-2ELISA的结果提示，当以0.5μg/ml为起始浓度刺激大鼠成骨细胞时，TH促成骨细胞分泌BMP-2的高峰出现在刺激后的12h，随后开始下降；而PT的促分泌效果在24h的观察周期内始终呈上升趋势；TH+PT的促分泌趋势与TH相当，最高峰也出现在12h，且峰值较TH更高；空白对照组BMP-2的高峰出现得最早，且24h的浓度最低。ELISA的结果还提示，当TH分别以0、0.1、1、10、25μg/ml的浓度梯度刺激成骨细胞时，BMP-2的分泌高峰出现在10μg/ml；而PT刺激组的分泌高峰出现在1μg/ml；TH+PT刺激组的分泌高峰则出现在10μg/ml。经RT-PCR证实，1ug/ml的PT会促进成骨细胞对BMP-2的表达增强。qRT-PCR的结果也证实，经0.1mg/ml的PT刺激后，成骨细胞对BMP-2的表达明显增强(p=0.000)。4．3．自体PT促进骨修复兔双侧桡骨缺损修复术后的X线评分结果提示，术后1w时，自体PT修复侧（实验侧）与对照侧的评分值均为0。随着观察时间的延长，双侧的骨缺损都有渐进性的修复，表现在X线评分则为分值逐渐增加。而且，自术后4w始，实验侧的分值明显高于对照侧分值（p=0.021）。图像分析的结果提示，在术后1w、4w、8w及16w，实验侧缺损面积均小于对照侧，以术后8w最明显，且差异具有显着性意义（p=0.045）。4．4．骨库制备技术对骨组织中PT的破坏经大鼠凝血酶原免疫组化染色证实，新鲜皮质骨中存在有大量的PT，且大部分与骨细胞一起位于骨陷窝内。而对比发现，经脱脂、脱蛋白、冻干及辐照等处理后，皮质骨内的骨细胞基本上被彻底清除干净，遗留下许多空泡状的陷窝；而与此同时，原本存在于新鲜异体骨中的PT也被清除干净。4．5．HPIFIAB扫描电镜的结果提示，在冻干异体骨的髓腔面，可清晰看到髓腔壁的骨小梁结构，而在皮质面，则能清晰看到皮质骨表面的滋养孔。在经壳聚糖包被冻干异体骨的髓腔面及皮质面，上述骨组织表面的正常结构被均匀的壳聚糖膜覆盖。经冻干并烘烤后的人PT-PLGA微球，其外形呈表面多孔的圆饼状，直径约为100μm，厚度约为40μm。HPIFIAB髓腔面及皮质面，分布着大小不一的微球，微球直径约为2～10μm。与单纯凝血酶原微球的多孔状表面不同，负载于冻干异体骨的微球其表面尚包裹一层光滑的壳聚糖膜。通过ELISA测定出微球的包封率为74.93%，而且在体外测出了经单纯壳聚糖以及壳聚糖-PLGA微球缓释的PT浓度曲线。从曲线上各个时间点两组的PT浓度值可见，以单纯壳聚糖为缓释载体，其溶液中释放出来的PT浓度较以壳聚糖-PLGA微球为高，且各时间点的浓度均值及标准差起伏较大。相比较而言，经壳聚糖-PLGA微球缓释后，各时间点溶液中PT的浓度均较低，且起伏波动不大，各时间点的浓度标准差也较小。从整体观察周期来看，以单纯壳聚糖为缓释载体的溶液在缓释第一天内出现了“突释”现象，PT的浓度在第一天达到了峰值，而在随后的观察周期内，虽有起伏，但PT浓度整体呈下降趋势；而以壳聚糖-PLGA微球为缓释载体的溶液则看不到对PT的“突释”，在长达30天的观察周期内，PT浓度始终维持平稳，没有出现明显的突释现象。四、结论：1．CFAH的止血机制及改性初探1．1．Schiff碱合成方案与多肽合成方案均能成功地将邻苯二酚结构桥接至壳聚糖，使壳聚糖在化学层面具备了像贝壳一样发生水下粘附的物质基础。1．2．与Schiff碱合成方案相比，多肽合成方案能够在化学修饰壳聚糖的同时保留壳聚糖的止血作用，因而更适合于本项目的后续研究。1．3．游离氨基对于壳聚糖止血剂的止血性能而言，发挥着“不可或缺”的关键作用。1．4．止血剂微观表面形貌的高度一致性，是其具备粘附特性的必备条件之一。2． LTVS装置的研究2．1．与美军现有的TVS相比，LTVS的吻合时间可以缩短60.37%。2．2．与美军现有的TVS相比，LTVS的吻合强度至少可以提高114.29%。3． ACIFIAB的研究3．1．冻干辐照异体骨比新鲜冷冻异体骨软，更容易被打压。3．2．就骨块的瞬时形变率而言，冻干辐照异体骨与新鲜冷冻异体骨不分伯仲，有望为髋臼假体提供相似的初期稳定性。3．3．由于新鲜血凝块尚能促进冻干辐照异体骨的再血管化与骨改建，我们推荐在髋臼翻修时，将冻干异体骨和自体新鲜血凝块预混后一并植入。4． PT的研究4．1．PT可以促进成骨细胞的增殖及对BMP-2的分泌。4．2．与TH不同，高浓度的PT对成骨细胞的增殖没有明显的抑制作用。4．3．局部补充自体PT可以有效促进大段骨缺损的修复。4．4．现有的骨库技术对骨组织中的PT破坏严重。4．5．借助于缓释技术，PT有望成为一种新型的促成骨因子应用于临床。总之，对壳聚糖急救止血剂止血机制与改性的初步研究，从物理化学双重层面揭示了止血剂的止血和粘附机制，有望在此基础之上进一步研发兼具止血和粘附性能的优秀止血剂；锁定暂时性血管分流装置，能够缩短吻合时间，增强吻合强度，并进一步提高分流管的抗凝特性，有望进一步提高暂时性血管分流技术的救治效率和安全性；自体血凝块预混的冻干异体骨和凝血酶原，能够进一步改善骨移植材料的血液供应和促进成骨，有望应用于大段骨缺损的治疗。因此，有必要对上述产品和技术开展后续研发，从而进一步提升我军对战时严重四肢伤的整体救治水平。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
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