美洲型PRRSV二价核酸疫苗的制备及小鼠的免疫研究

论文摘要

猪繁殖与呼吸综合征(Procine Reproductive and Respiratory Syndrome,PRRS 最早于1987年在美国报道,自爆发以来,给养猪业造成了严重的经济损失。在1995年左右传入中国,引起该病的的病原为猪繁殖与呼吸综合征病毒（Procine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus,PRRSV）。我国流行的主要是美洲型PRRSV及其变异株,近些年来我国PRRSV谱系呈多样化趋势,增加了我国对PRRS的预防和治疗的难度。JXA1-like谱系毒株是PRRS爆发以来比较流行的高致病性PRRSV（HP-PRRSV）,而NADC30-like谱系毒株是近些年流行的HP-PRRSV。通过这两个谱系构建的二价核酸疫苗将是一种非常理想的防控PRRSV的新型疫苗。从某发病猪场采集样本采集到一株PRRSV将其命名为YN-L株。对其进行全基因扩增,然后对其Nsp2、GP5基因和全基因组进行遗传进化分析及同源性比对,并对其Nsp2、GP5基因编码的氨基酸的序列进行比对,证实该YN-L株为JX41-like谱系毒株。对YN-L毒株的理化特性进行研究,结果表明,YN-LQ毒株不耐热、不耐酸和碱,对乙醚、氯仿和紫外线敏感,对胰蛋白酶和超声波不敏感。将YN-LQ株的ORF5基因与NADC30-Lie的ORF5基因通过自裂解Linker进行连接,再与pVAX1载体连接构建二价核酸疫苗,转染至BHK细胞,用蛋白免疫印迹（Western Blot）等方法进行验证。结果显示,二价核酸疫苗可表达GP5（JXA1-Like）-Linker-GP5（NADC30-Like）目的蛋白。将所构建的二价核酸疫苗进行小鼠免疫研究,实验结果显示,二价核酸疫苗加佐剂组可提高小鼠的体液免疫和细胞免疫,具有较好的免疫原性。IL-4和IFN-γ细胞因子检测显示免疫35d时,二价核酸疫苗加佐剂组均高于二价核酸疫苗组。中和抗体检测显示免疫35d时,二价核酸疫苗加佐剂组高于其它组,中和抗体滴度最高达1:17.77。CD3+CD4+和CD3+CD8+血清细胞因子检测结果显示35d时,二价核酸疫苗加佐剂组均高于二价核酸疫苗组。T淋巴细胞增殖实验结果显示:特异性刺激组的刺激指数（SI）高于非特异性刺激组,二价核酸疫苗加佐剂组和二价核酸疫苗组高于其它组。在特异性刺激中,二价核酸苗加佐剂组高于二价核酸疫苗组;在非特异性刺激中,二价核酸疫苗加佐剂组也高于二价核酸疫苗组。综上,联合佐剂可提高二价核酸疫苗的免疫效果,为美洲型PRRSV疫苗的进一步研发奠定基础。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 前言
•   1 PRRSV的流行现状
•     1.1 PRRSV在世界的历史和流行状况
•     1.2 PRRSV在中国的历史和流行状况
•   2 PRRSV的基因组结构
•   3 PRRSV的蛋白结构
•   4 PRRSV引发的先天性细胞免疫反应
•     4.1 树突状细胞（DC）
•     4.2 巨噬细胞（MΦ）
•     4.3 中性粒细胞（PMN）
•     4.4 自然杀伤细胞（NK）
•     4.5 γδT细胞
•   5 PRRSV与PCV2发生共感染
•   6 NADC30-Like谱系的PRRSV
•     6.1 NADC30-Like谱系PRRSV的基因组特征
•     6.2 NADC30-Like谱系PRRSV重组率高
•     6.3 NADC30-Like谱系PRRSV的致病性
•     6.4 目前商用疫苗对NADC30-Like谱系PRRSV的疗效
•   7 PRRS疫苗设计的挑战
•   8 研究目的及展望
• 材料与方法
•   1 材料
•     1.1 毒株、细胞、质粒及小鼠
•     1.2 主要试剂
•     1.3 主要仪器
•   2 方法
•     2.1 PRRSV YN-LQ株的全基因序列测定及遗传进化分析
•     2.2 YN-LQ毒株的理化特性检测
•     2.3 二价核酸疫苗的构建及小鼠的免疫研究
• 结果
•   1 PRRSV YN-LQ株的全基因序列测定及遗传进化分析
•     1.1 PRRSV YN-LQ株全基因扩增结果
•     1.2 Nsp2和GP5基因进化树分析及同源性比对
•     1.3 全基因组遗传进化分析及同源性比对
•     1.4 GP5、Nsp2编码的氨基酸的序列比对
•   2 YN-LQ毒株理化特性的研究
•     2.1 YN-LQ毒株耐热试验
•     2.2 YN-LQ毒株耐酸、碱试验
•     2.3 YN-LQ毒株耐乙醚试验
•     2.4 YN-LQ毒株耐氯仿试验
•     2.5 YN-LQ毒株对胰蛋白酶的敏感性试验
•     2.6 YN-LQ毒株对超声波的敏感性试验
•     2.7 YN-LQ毒株对紫外线的敏感性试验
•   3 二价核酸疫苗的构建及小鼠的免疫研究
•     3.1 pGH-HP-ORF5 （JXA1-Lke）-Linker-ORF5（NADC30-Like）质粒的双酶切验证
•     3.2 pVAX1-HP-ORF5（JXA1-Like）-Linker-ORF5（NADC30-Like）质粒双酶切验证
•     3.3 Western Blot检测
•     3.4 细胞因子检测（IL-4、IFN-γ）
•     3.5 中和抗体检测
• +CD4⁺、CD3⁺CD8⁺）'>    3.6 T淋巴细胞亚群数量的检测（CD3⁺CD4⁺、CD3⁺CD8⁺）
•     3.7 T淋巴细胞增殖实验
• 讨论
• 结论
• 参考文献
• 致谢
• 附录A （作者简历）
• 附录B （攻读学位期间发表论文目录）

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 张涵

导师: 李太元,金宁一

关键词: 美洲型,二价核酸疫苗,联合佐剂,免疫原性

来源: 延边大学

年度: 2019

分类: 基础科学,农业科技

专业: 生物学,生物学,畜牧与动物医学

单位: 延边大学

分类号: S852.65;S852.4

总页数: 61

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