高可溶性绿色荧光蛋白在大肠杆菌中的表达分析

论文摘要

随着基因组学、生物信息学和蛋白质组学的快速发展,大量未知蛋白质的功能需要鉴定。融合蛋白标签技术的发展,为研究蛋白质的细胞内定位、相互作用和分离纯化等提供了有效的工具。目前已有许多融合标签系统在重组蛋白质表达中得到广泛应用。但仍存在操作程序复杂、成本昂贵和周期长等问题。一个理想的蛋白质标签是由基因编码,在体内和体外均能起作用,且提供一个敏感的分析信号,并不影响甚至促进目的蛋白质的可溶性表达。在原核表达系统中,未经改造的绿色荧光蛋白（wild type GFP,wtGFP）的表达产物大部分是不可溶的,即易形成包涵体。其作为一种报告基因,以其独特的优势广泛用于基因的表达与调控、蛋白质的定位、转移及相互作用、信号传递、转染与转化,以及细胞的分离与纯化等研究领域。其折叠易受温度影响,发光较弱,应用到某些多层植物细胞中不容易观察。后期改造的增强型GFP（enhanced GFP,eGFP）荧光强度得到提高,但在原核表达系统中其产物也只是少部分可溶。其若作为应用标签,不利于可溶性重组蛋白结构、功能和生化性质的研究。本实验以绿色荧光蛋白（green fluorescent protein,GFP）为研究对象,探讨可溶性表达重组蛋白的问题。并研究了重组蛋白在大肠杆菌中可溶性表达的策略:包括载体和宿主菌株的选择以及培养参数、密码子优化等。本研究根据密码子在大肠杆菌中表达的偏爱性,利用突变GFP的某些氨基酸位点可以使其形成超折叠结构的特性,突变其编码16个氨基酸的核苷酸序列。在大肠杆菌BL21（DE3）中表达利用基因工程手段合成的可溶性GFP（soluble GFP,sGFP）,以eGFP作为对照,载体pET-29b（+）作为空对照,研究其荧光强度、可溶性,并建立其可溶性表达条件。通过植物活体荧光影像仪（NightSHADE LB 985）检测eGFP和sGFP的荧光强度。在异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）浓度020μm的范围内,细胞内sGFP的平均荧光强度始终强于eGFP。当IPTG诱导浓度为15μm时,两者荧光强度最强,sGFP荧光强度比eGFP高2.897倍。因此确定eGFP和sGFP最佳诱导浓度为15μm。为了进一步检测sGFP的高荧光特性和可溶性,在最优诱导条件下诱导蛋白表达,经超声波破碎后,分析其上清和沉淀。结果显示,在可见光下sGFP上清呈黄色,eGFP上清呈微黄色。在紫外激发光360 nm下,sGFP显示较强的绿色荧光,并且上清的荧光强度明显高于沉淀,eGFP绿色荧光不明显,沉淀的荧光强度微高于上清。为了进一步表明sGFP的高荧光特性,诱导表达sGFP和eGFP。结果表明,sGFP单菌落荧光强度强于eGFP,实现其可见光下的可视化检测。通过NightSHADE LB 985分析其上清与沉淀,sGFP与eGFP荧光强度存在明显差异。结果显示,sGFP上清中的平均荧光强度比其沉淀的高21.93倍,同时比上清中eGFP的平均荧光强度高29.05倍。分析数据显示,sGFP具有高荧光特性,也初步表明sGFP在大肠杆菌中的表达具有高度可溶性。为进一步验证sGFP的高可溶性,通过SDS-PAGE电泳,分析其总蛋白、上清和沉淀。利用Tanon GIS软件对凝胶照片蛋白质斑点的灰度密度值进行计算,结果显示,sGFP的可溶性高于eGFP,两者可溶性分别达到82.72%和41.25%。利用sGFP所具有的强荧光特性及高可溶性,可开发一种操作简单且根据荧光测量单位测定融合目的蛋白质可溶性百分比的指示工具。本实验对sGFP进行纯化。运用BCA法对sGFP进行浓度测定,结果显示sGFP浓度为458.5 ng/μL。并建立不同sGFP浓度与其荧光强度之间的数量对应关系,结果显示,sGFP的荧光强度（cps）与其分子量（ng/uL）呈良好的线性对应关系。sGFP的浓度在低于0.8 ng/μL的情况下,仍能检测到荧光强度,充分证明其高灵敏度。为其融合目的蛋白并评估目的蛋白的可溶性表达浓度提供荧光强度指示。利用此方法评估目的蛋白的可溶性及浓度,操作简单。本实验同时为开发蛋白质细胞内定位以及弱蛋白之间的相互作用等提供了一个灵敏、省时、易于可视化分析的有力工具,也为开发可溶性融合蛋白标签提供了技术可能性。

论文目录

• 摘要
• abstract
• 前言
• 第一章 绪论
•   1.1 大肠杆菌基因表达系统
•     1.1.1 表达宿主菌
•     1.1.2 表达载体
•   1.2 外源蛋白可溶性表达策略
•     1.2.1 寄主菌株的选择
•     1.2.2 载体的选择
•     1.2.3 改变培养参数
•     1.2.4 密码子优化
•   1.3 绿色荧光蛋白
•     1.3.1 GFP的来源、结构及发光机制
•     1.3.2 突变GFP功能研究现状
•     1.3.3 GFP在生物领域的最新应用进展
• 第二章 材料与方法
•   2.1 实验材料
•     2.1.1 菌株与质粒
•     2.1.2 主要试剂
•     2.1.3 主要仪器设备
•     2.1.4 PCR引物、目的基因合成和测序
•     2.1.5 培养基与主要溶液配制
•   2.2 实验方法
•     2.2.1 氯化钙法制备新鲜的大肠杆菌DH5α感受态
•     2.2.2 目的片段的获取方法
•     2.2.3 酶切反应
•     2.2.4 纯化目的片段与载体
•     2.2.5 连接反应
•     2.2.6 质粒或连接产物转化
•     2.2.7 菌落PCR快速筛选与鉴定重组子
•     2.2.8 质粒DNA的提取
•     2.2.9 琼脂糖凝胶电泳分析
•     2.2.10 表达载体pET-eGFP和 p ET-sGFP的构建
•     2.2.11 荧光强度测定
•     2.2.12 诱导蛋白表达
•     2.2.13 SDS-PAGE电泳
•     2.2.14 sGFP浓度与其荧光强度之间的对应关系
• 第三章 结果与分析
•   3.1 表达载体的构建
•     3.1.1 扩增基因eGFP
•     3.1.2 重组质粒p ET-eGFP、pET-sGFP的鉴定
•   3.2 荧光蛋白诱导表达分析
•     3.2.1 最佳IPTG诱导浓度鉴定
•     3.2.2 荧光强度分析
•   3.3 荧光蛋白SGFP的可溶性验证
•   3.4 SGFP标准曲线
• 第四章 讨论与展望
•   4.1 讨论
•   4.2 展望
• 参考文献
• 附录
•   缩略语表
• 致谢
• 攻读硕士学位期间发表的学术论文

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 张俊华

导师: 曹雪松

关键词: 绿色荧光蛋白,大肠杆菌,可溶性表达

来源: 聊城大学

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学

单位: 聊城大学

分类号: Q78

DOI: 10.27214/d.cnki.glcsu.2019.000397

总页数: 58

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