韦艳丹1曾华松2
(1.广州市花都区妇幼保健院2.广州市妇女儿童治疗中心,广东广州510000)
［摘要］目的探讨白细胞介素６（ＩＬ－６）基因－１７４Ｃ／Ｇ多态性与广州地区汉族儿童脓毒症的易感风险及预后的关联性。方法以人群为基础进行脓毒症病例对照研究，应用等位基因特异性扩增多聚酶链(AS-PCR)方法对广州地区汉族148例脓毒症患儿及181例正常健康儿童进行ＩＬ－６基因－１７４Ｇ／Ｃ多态性进行检测分析。结果AS－PCR检测未发现－１７４位点多态性。结论中国广州地区汉族人群ＩＬ－６基因可能不存在－１７４位点多态性,不宜选取该基因位点单核苷酸多态性作疾病的关联性分析。
［关键词］脓毒症；白细胞介素６；多态性，单核苷酸；疾病遗传易感性
CorrelationbetweenIL-6genepolymorphismsandsepsisofchinachildreninGuangzhouprovinceWeiYan-dan1,ZengHua-song2(1.HuaduDistrictMaternity﹠ChildHealthcareHospital2.GuangzhouWomenandChildrenMedicalCenter,Guangzhou510000china)[Abstract]objectivetoinvestigatethecorrelationbetween–174G/CpolymorphismsofIL-6geneandsepsisofChinesechildreninGuangzhouprovince[Methods]Apopulation–basedcase–controlstudyinvolving148patientswithsepsisand181healthvolunteers(control）wascarriedout,The174G/CpolymorphismsofIL-6geneWasanalyzedbyusingallelespecialpolymerasechainreaction(AS-PCR)amplification．[Results]Nowasfound-174site(GGgenotypeonly),andnosignificantdifferenceofallelefrequencyexistedbetweenpatientsandcontrols.Notobeselectedthegenesitsfordiseaseassociationanalysis.
[Keywords]sepsis;interleukin-6;polymorphism;singlenucleotide；geneticpredispositiontodisease;children.
脓毒症（Sepsis）是感染引起的全身炎症反应综合症(SIRS)。SIRS是机体对天然免疫系统过度活化的结果，因而脓毒症被认为是失控的免疫炎症反应，是众多细胞因子、化学介质参与的复杂级联免疫反应。在长期与脓毒症这一医学难题斗争的临床观察表明，不同个体的患者间表现出高度差异性。随着人类基因组学研究的不断进展，人们认识到这种个体差异可能与基因多态性有关。而白细胞介素六（ＩＬ－６）是脓毒症发生、发展中功能最为广泛的炎性细胞因子之一，其血清浓度与脓毒症的严重程度及预后有关［1］。研究脓毒症重要相关炎性因子的基因多态性可对脓毒症的易感性及评估疗效和预后提供依据。本研究选取中国广州地区汉族儿童人群，检测健康儿童及脓毒症患儿的ＩＬ－６基因－１７４Ｃ／Ｇ位点多态性基因分布特征并分析与脓毒症易感转归的相关性，为研究脓毒症的发病机制及个体化治疗提供依据。
1.对象和方法
1.1对象
采集从2007年4～12月在广州市儿童医院诊治的汉族脓毒症患儿148例外周血标本,同期收集汉族健康对照181例外周血标本.所有标本均采自广州市居住儿童。健康对照组为健康查体儿童,否认采血前1月有发热,咳嗽,腹泻等感染症状,查体无心、脑、肺等器官异常,采血查血象在正常范围。脓毒症患儿为疾病组,其中普通脓毒症患儿65例，重症脓毒症患儿83例；普通脓毒症患儿中有7例最后发展至重症脓毒症；脓毒症患儿中死亡12例。脓毒症疾病组入选标准按中华儿科杂志2006年8月第44卷第8期发表的儿科感染性休克(脓毒性休克)诊疗推荐方案中的诊断标准[2]。
脓毒症组148例,男94例、女54例,年龄(32.4±20.4)月；健康对照组181例，男114例，女67例，年龄（40.8±16.8）月。两组年龄和性别构成比差异无统计学意义(P分别为0.920和0.102)。其中普通脓毒症组65例，男36例、女29例，年龄（38.3±23.4）月；重症脓毒症组83例，男56例、女27例，年龄（28.8±3.6）月。
1.2方法
1.2.1外周全血基因组DNA的提取
抽取受试者空腹外周静脉血1.0mL加抗凝剂EDTA0.2～0.5mL混匀抗凝,按QIAampDNABloodMiniKit(Qiagen,Hilden,Germany)的操做指南进行外周全血基因组DNA提取;并将抽取的DNA样本标志好后于-20℃冰箱保存供后续实验使用.
1.2.2PCR引物合成
参照文献[3]合成IL-6-174的PCR引物，G特异性引物为5-GCACTTTTCCCCCTAGTTGTGTCTTACG-3；C特异性引物为5-ATGACGACCTAAGCTTTACTTTTCCCCCTAGTTGTGTCTTGAC3
共同下游引物为：5-ATAAATCTTTGTTGGAGGGTGAGG3。引物由上海生工生物技术有限责任公司合成.
1.2.3PAI-1基因的PCR扩增
G上游引物与共同下游引物PCR反应总体积25.0μL,反应体系Greenmastermix,2×,(Promega，Madison,USA)8.5μL,G特异性引物及共同下游引物均为（0.8-1.0）μmol/L,模板200～250mg,最后加纯水补至25.0μL(C上游引物与共同下游引物的PCR反应体系与之相同)。
1.2.4等位基因PCR扩增程序为:95℃预变性10min,然后94℃35ses,61℃45ses,72℃45ses,共30个循环,最后72℃延伸5min。
1.2.5PCR产物琼脂糖凝胶电泳,IL-6-174G/C多态性检测各取G、C等位基因PCR产物(10-15)μL于20g/L琼脂糖凝胶(0.5mg/LEtBr)在EPS-300电泳仪（稳压稳流电泳仪，上海天能科技有限公司）中电泳(80～90V,30～45min),以DL200DNAMarker为分子量标准。将凝胶放置GelDocEQ凝胶成像系统（bio-RADGelDocXR，USA）进行摄像分析。
根据电泳图上相应等位基因泳道是否出现条带来判断结果：一个样本G/C基因型测定由两个泳道决定。G/G基因型在G等位基因泳道上产生121bp条带，而在C/C基因型在C等位基因泳道上产生一个136bp条带；G/C基因型在G及C两等位基因泳道均产生121bp和136bp两种长度的条带.（图1）
图1：G表达G等位基因泳道；C表达C等位基因泳道，1-5：表示标本号
为确保实验数据的准确，减少误差，基因型的分型均由两个人判读，并随机抽取１5％重复，同时随机抽取10％产物直接测序（上海英骏生物技术有限公司），准确率均为１００％。
２结果
采用PCR等位基因扩增方法对广州地区汉族儿童人群300余例（正常健康对照181例及脓毒症患儿148例）外周血标本进行ＩＬ－６基因－１７４位点等位基因检测，结果仅发现Ｇ等位基因。其分布频率为100%，未测及Ｃ等位基因。
３讨论
随着人类基因组学研究的深入，已认识到脓毒症是由环境因素(病原微生物等)和遗传因素共同作用的多基因征侯群，个体遗传学机制的差异性是脓毒症个体差异的内因物质基础[4]。促炎／抗炎反应失控与脓毒症的发生发展密切相关，而ＩＬ－６是脓毒症的主要炎性因子之一[5]，对其进行基因多态性研究，可为脓毒症易感人群的早期识别、预后分析和免疫治疗提供新的理论依据。
人ＩＬ－６基因的多态性主要为存在于启动子区的－５９７Ｇ／Ａ、－５７２Ｃ／Ｇ、－１７４／Ｇ／Ｃ、－１３７ＡｎＴｎ［6］。理论上ＩＬ－６启动区的任何多态性都有可能改变基因的结合序列，影响个体对ＩＬ－６基因相关性疾病的易感性。鉴于－５９７Ｇ／Ａ与－１７４Ｇ／Ｃ［7］处于连锁不平衡，故本研究仅观察了－１７４Ｇ／Ｃ多态性的分布与作用。国外有研究显示，ＩＬ－６基因启动子区－１７４位点变异可影响其基因表达，C／C基因型的携带者血浆ＩＬ－６水平明显低于G／C及G／G基因型个体[8]。但该位点多态性与疾病相关性国外报道有所差异。Akira等的研究表明，ＩＬ－６基因－１７４Ｇ／Ｃ多态性与西方人群中的某些疾病如2型糖尿病、系统性红斑狼疮等相关性密切[3,9,10]；但Schluter等研究证实，术后发生脓毒症和未发生脓毒症患者间的G/C基因分布无差异性且G/C基因与内毒素（LPS）刺激全血白细胞产生ＩＬ－
６水平的能力也无差异[11]。
国内蒋建新等对我国10个代表性民族人群中的18个脓毒症相关基因进行单核苷酸多态性研究分析，结果显示，在我国人群中发生频率>5%的常见变异有91个，国外有报道80个，占88%；发生频率>10%的有67个，国外有报道64个，占96%。可见在西方人群和东方人群中，大多数基因组多态性是相同的，尤其是常见变异[12]。ＩＬ－６－１７４Ｇ／Ｃ多态性分布频率在国外的研究中，人群发生率最低亦接近10%。但本研究中广州地区汉族儿童人群仅发现ＧＧ基因型，未发现ＧＣ和ＣＣ基因型，与国外报道存在三种基因型有明显差异；表明在广州地区汉族儿童中IL-6基因-174G/C多态性存在与欧美人种具有完全不同的频率分布特征。与国内某些地区如广西、河南、深圳的研究报道结果相同[13，14]，而我国其他地区的研究结果显示ＧＣ和ＣＣ基因型在人群分布频率极低，不足2%，而ＣＣ基因型则罕测及[15，16]。
总之，本研究探索了ＩＬ－６－１７４Ｇ／Ｃ多态性与我国广州地区汉族儿童脓毒症的关联性，结果显示我国汉族人群IL-6-174C/G多态性基因型分布特征与欧美人种有明显差异性,可能不存在－１７４位点多态性，不宜选取该基因位点单核苷酸多态性作疾病的关联性分析。
参考文献
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作者简介：韦艳丹（1976-），女，广西上林人，主治医师，硕士研究生，现主要从事儿科工作。