![深海嗜热菌Caloranaerobacter azorensis H53214 [FeFe]-氢酶基因异源共表达及产氢分析](https://www.lunwen90.cn/thumb/c197f9674ad650bd094f1d63.webp)
论文摘要
目前,经济的迅速发展导致二氧化碳排放增加,随之而来的是全球气温飙升,海洋环境日益恶化,导致人类生存受到威胁。减少碳排放量,减少化石燃料的利用,寻找无污染的新型能源势在必行。氢气作为清洁、高质量能比、高能量产值的能源备受关注。生物制氢具有原料来源广泛,耗能少,成本低等优点,是最近研究的热点之一。本实验将来源于Caloranaerobacter azorensis H 53214的一种新型[FeFe]-氢酶结构基因hyd A2及其3个成熟蛋白基因（hydE,hydF,hyd G）以共表达方式插入到含有的[NiFe]-氢酶的Koxytoca HP1中,构建了新的重组菌株HPl-Hyd。利用IPTG诱导四个蛋白表达,在厌氧条件下,成熟蛋白Hyd E、Hyd F、Hyd G能催化激活Hyd A2蛋白成为有活性的[FeFe]-氢酶。在[NiFe]-氢酶和[FeFe]-氢酶两种氢酶的共同催化,1 mL菌液利用葡萄糖暗发酵产氢总量提高了26%,最大产氢速率相较于野生型菌株118.3 mL/L/h,增长到了 145.8 mL/L/h。相较于野生型菌株酶活0.79 U,其酶活达到了1.71 U。对其氢酶理化性质进行研究,结果表明在60℃,pH为7.5,完全厌氧时酶活达到最高,这也与提供[FeFe]-氢酶的深海嗜热菌H53214和从温泉分离的Koxytoca HP1所处环境相符。以前的研究表明Koxytoca HP1在暗发酵产氢过程中,主要是通过甲酸裂解方式产氢。本研究通过实时荧光定量PCR分析得出重组菌株中影响甲酸裂解途径催化效率的[NiFe]-氢酶大小亚基表达量降低,对比分析了重组菌株利用甲酸为底物的发酵产氢能力。结果表明,与野生型K.oxytoca HP1产氢效率为86.35 mL/L/h相比,重组菌株甲酸钠发酵产氢能力产氢效率为68.53 mL/L/h。虽有所降低,但仍然保持较高活性。通过对葡萄糖发酵过程中代谢途径分析发现,与野生菌相比,重组菌株产氢发酵液中2,3-丁二醇含量减少0.0201 mol/mol Glu,乙醇含量减少0.0414 mol/mol Glu,乳酸含量减少0.0226 mol/mol Glu,代谢支路总NADH减少,说明利用NADH产氢能力增强。本论文实验结果证明了外源深海[FeFe]-氢酶的表达可改变K.oxytoca HPl产氢途径并提高产氢效率,为产氢微生物的改造提供了新的思路。
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英文缩略语表摘要Abstract1 前言 1.1 氢能源重要性 1.2 生物制氢 1.2.1 水的生物光解 1.2.2 光致发酵 1.2.3 暗发酵产氢 1.3 氢酶结构及催化机理 1.3.1 氢酶的结构 1.3.1.1 [NiFe]-氢酶 1.3.1.2 [FeFe]-氢酶的结构 1.3.1.3 [Fe]-氢酶的结构 1.3.2 氢酶的催化机理 1.4 氢酶的成熟及表达调控 1.4.1 [FeFe]-氢酶的成熟及表达调控 1.4.2 [NiFe]-氢酶的成熟及表达调控 1.5 氢酶的应用 1.6 本文研究的主要内容和意义2 材料与仪器 2.1 材料 2.1.1 菌种和质粒 2.1.2 引物 2.1.3 培养基的配制 2.1.4 菌体的培养 2.1.4.1 K.oxytocaHP1菌种、E.coli DH5α菌种的培养 2.1.5 常用药品及仪器 2.1.6 实验试剂的配置3 实验方法 3.1 分子克隆相关实验2与成熟蛋白Hyd E、Hyd F、Hyd G共表达策'> 3.1.1 Hyd A2与成熟蛋白Hyd E、Hyd F、Hyd G共表达策 3.1.2 C.azorensis H53214总DNA的提取 3.1.3 大肠杆菌/克雷伯氏菌感受态细胞的制备 3.1.4 质粒DNA小提 3.1.5 DNA样品琼脂糖凝胶电泳 3.1.6 琼脂糖回收DNA片段2重叠PCR扩增'> 3.1.7 GST-hydA2重叠PCR扩增 3.1.8 hydE,F,G基因PCR扩增 3.1.9 质粒DNA转化 3.1.10 构建单基因原核表达质粒 3.1.11 构建双基因原核表达质粒 3.1.12 构建原核共表达菌株 3.2 基因诱导表达验证与纯化 3.2.1 IPTG诱导目的蛋白的表达 3.2.2 实时荧光定量PCR检测验证 3.2.2.1 总RNA的提取 3.2.2.2 RNA质量检测 3.2.2.3 反转录 3.2.2.4 qPCR 3.2.3 Western Blot检测 3.2.4 可溶性目的蛋白的制备 3.2.4.1 菌体蛋白的获取 3.2.4.2 GST磁珠纯化蛋白 3.2.4.3 SDS-PAGE检测蛋白 3.3 重组菌株产氢能力测定 3.3.1 生长曲线的测定 3.3.2 产氢能力的测定 3.3.3 发酵底物葡萄糖的测定 3.3.3.1 葡萄糖标准曲线的制定 3.3.3.2 样品的测定 3.4 氢酶理化性质研究 3.4.1 粗酶液的提取 3.4.2 蛋白浓度测定 3.4.2.1 蛋白浓度标准曲线的制定 3.4.2.2 样品的测定 3.4.3 氢酶酶活检测 3.4.4 温度对HP1-Hyd氢酶酶活影响 3.4.5 pH对HP1-Hyd氢酶酶活影响 3.4.6 氢酶耐氧性研究 3.5 甲酸产氢途径的研究 3.6 代谢产物的测定4 实验结果 4.1 原核表达载体的构建2基因的克隆'> 4.1.1 GST-hyd A2基因的克隆 4.1.2 [FeFe]-氢酶成熟蛋白基因的克隆 4.1.3 hyd F/pETDuet-1重组载体的构建 4.1.4 hyd G/pCDFDuet-1重组载体的构建2/F-pETDuet-1重组质粒'> 4.1.5 构建GST-hyd A2/F-pETDuet-1重组质粒 4.1.6 构建hyd E/hyd G-pCDFDuet-1重组质粒 4.1.7 原核共表达菌株HP1-Hyd-1的构建 4.2 重组菌株HP1-Hyd的构建 4.3 重组菌株HP1-Hyd的表达和纯化 4.3.1 重组菌株HP1-Hyd的SDS-PAGE凝胶电泳分析 4.3.2 实时荧光定量PCR分析 4.3.2.1 [FeFe]-氢酶基因实时荧光定量PCR分析 4.3.2.2 [NiFe]-氢酶大小亚基实时荧光定量PCR分析 4.3.3 Western Blot分析 4.3.4 可溶性目的蛋白的制备 4.4 重组菌株产氢能力分析 4.4.1 生长曲线的分析 4.4.2 产氢能力的分析 4.4.3 发酵产物葡萄糖的分析 4.4.3.1 葡萄糖标准曲线 4.4.3.2 发酵底物中葡萄糖的分析 4.5 重组氢酶活性分析 4.5.1 蛋白浓度标准曲线 4.5.2 氢酶酶活分析 4.5.3 温度对重组菌株HP1-Hyd氢酶酶活影响 4.5.4 pH对重组菌株HP1-Hyd氢酶酶活影响 4.5.5 氢酶耐氧性研究 4.6 甲酸产氢途径的分析 4.7 代谢产物的分析5 实验讨论 5.1 [FeFe]-氢酶基因的克隆和共表达载体的构建 5.2 [FeFe]-氢酶蛋白的表达 5.3 HP1-Hyd菌株产氢分析 5.4 HP1-Hyd菌株酶活理化性质分析 5.5 HP1-Hyd菌株代谢产物分析6 结论与展望 6.1 实验结论 6.2 实验展望附录参考文献致谢
文章来源
类型: 硕士论文
作者: 李馨培
导师: 邬小兵
关键词: 氢酶,代谢产物
来源: 厦门大学
年度: 2019
分类: 基础科学
专业: 生物学
单位: 厦门大学
分类号: Q939.9
总页数: 101
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标签：氢酶论文; 代谢产物论文;
深海嗜热菌Caloranaerobacter azorensis H53214 [FeFe]-氢酶基因异源共表达及产氢分析
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