导读:本文包含了乳腺特异表达载体构建论文开题报告文献综述、选题提纲参考文献及外文文献翻译，主要关键词:乳腺,载体,基因,蛋白,细胞,上皮细胞,山羊。
乳腺特异表达载体构建论文文献综述
庞礴,于鸿浩,张湑泽,谢玲,付林[1]（2019）在《高原鼠兔瘦素蛋白乳腺特异表达载体的构建及细胞表达》一文中研究指出瘦素(Leptin)蛋白是调节机体能量代谢的关键因子之一。前期研究显示高原鼠兔Leptin蛋白发生了适应性进化。功能实验表明,在温暖或寒冷条件下高原鼠兔Leptin通过减少食物摄取和增加能量消耗调节能量平衡,显示了其调节适应性产热过程的潜力。本研究以高原鼠兔Leptin cDNA为模板扩增高原鼠兔obese (ob)基因编码区序列504 bp,改造并构建哺乳动物真核细胞乳腺特异表达载体pBC1-lep,同时通过组织块法原代培养建立奶山羊乳腺上皮细胞系,并通过pBC1-lep质粒脂质体法转染及转基因细胞的筛选,成功获得转染Leptin的阳性细胞。本研究为利用转基因动物实现奶山羊乳腺中特异表达高原鼠兔Leptin提供了一条可能的途径,完成了乳腺特异真核表达载体的构建。(本文来源于《兽类学报》期刊2019年01期）
张斯敏,高越,方彧聃,张金脉,张敬之[2]（2014）在《乳腺生物反应器特异高效表达载体的构建》一文中研究指出乳腺生物反应器具有广阔的开发前景,而提高目的基因的表达量是该领域一个重要的研究课题。因此,选用强的非特异性启动子pCAG,而不是乳腺特异性启动子来实现高效表达;通过Cre/loxP系统和山羊β-乳球蛋白启动区(pBLG)表达Cre重组酶来实现载体的自删除以达到乳腺特异表达的目的。方法:构建含PolyA终止信号的Cre乳腺特异表达元件PolyA-pBLG-cre,插至强启动子pCAG驱动的报告基因lacZ表达载体中,构建成乳腺特异表达载体pCBCZ(pCAG-loxPPolyA-pBLG-cre-loxP-lacZ)。转染细胞实验结果:PCR鉴定确认pCBCZ载体在小鼠乳腺上皮细胞(HC11)中发生Cre-loxP同源重组。X-Gal染色表明载体能驱动lacZ在HC11细胞中高效表达β-半乳糖苷酶,而在NIH 3T3细胞中仅少量表达。结论:构建的pCBCZ载体能高效驱动外源基因在乳腺细胞中表达,且具有较好的乳腺特异性,为研发乳腺生物反应器表达载体提供新的方法。(本文来源于《中国生物工程杂志》期刊2014年07期）
安辰瑞,李咏乐,詹俐楠,王春生,朴善花[3]（2014）在《乳腺特异的甜味蛋白Brazzein基因真核表达载体的构建》一文中研究指出为了建立通过山羊乳汁获取甜味蛋白Brazzein的方法,研究在人工合成甜味蛋白Brazzein基因的基础上,利用乳腺特异表达的pBC-1载体,构建Brazzein基因的真核表达载体。结果表明:所合成的Brazzein基因与GenBank中Brazzein序列的同源性为100%,构建的克隆载体STP-pMD18-Simple正确;将甜味蛋白Brazzein基因与pBC-1载体连接后,成功构建甜味蛋白Brazzein基因的乳腺特异性表达载体STP-pBC-1。(本文来源于《黑龙江畜牧兽医》期刊2014年07期）
韩雪洁,萨日娜,梁浩,李雪玲,李荣凤[4]（2014）在《人凝血因子Ⅸ乳腺特异表达载体的构建及细胞转染》一文中研究指出【目的】人凝血因子Ⅸ(human coagulation factorⅨ,hFIX)是凝血过程中的关键因子,对临床治疗血友病有着极其重要的意义。研究旨在构建人凝血因子Ⅸ乳腺表达载体,在猪乳腺上皮细胞中验证其乳腺特异表达能力,获得hFIX转基因雌性乳腺上皮细胞和猪胎儿成纤维细胞,为克隆乳腺特异表达人凝血因子Ⅸ的转基因猪做准备。【方法】按照TaKaRa公司RNAiso Reagent和Prime Script RT-PCR试剂盒的说明书,从人胎儿肝脏中提取RNA并扩增出人凝血因子Ⅸ(human coagulation factorⅨ,hFIX)cDNA序列,利用PCR方法扩增牛生长激素(BGH)polyA序列,将hFIX的cDNA序列与BGH polyA序列分别连接到表达载体pbCSN2-RC的牛酪蛋白(CSN2)启动子之后,构建带有新霉素抗性和红色荧光蛋白双筛选标记的乳腺特异性表达载体pbCSN2-hFIX-pA-RC。取本地屠宰的泌乳期猪乳房组织,利用组织块种植法培养猪乳腺细胞,并通过控时消化分离纯化猪乳腺上皮细胞,进行染色体分析后,挑选含有正常染色体数目的细胞,通过脂质体法将表达载体导入,经过G418筛选获得稳定表达红色荧光蛋白的转基因细胞,反转录、实时定量PCR验证乳腺表达载体构建的合理性和有效性。为了只对雌性胎儿成纤维细胞进行转基因操作,首先对培养的猪胎儿成纤维细胞进行SRY基因PCR扩增,确定其性别。之后,利用脂质体将证明有效的表达载体导入细胞,并进行G418和红色荧光蛋白表达筛选,对经过鉴定的阳性细胞进行扩大培养和冷冻保存,为下一步的体细胞克隆做准备。【结果】经PCR和酶切鉴定,人凝血因子ⅨcDNA和BGH PolyA成功克隆到载体pbCSN2-RC中,获得具有双筛选标记的pbCSN2-hFIX-pA-RC。转染后G418和红色荧光蛋白表达阳性的猪乳腺上皮细胞,经实时定量PCR鉴定,hFIX有高效表达,证明所构建载体具有指导人FIX在乳腺特异表达的能力,可以用于生产乳腺特异表达的动物。将构建的载体转入雌性猪胎儿成纤维细胞,经G418和红色荧光蛋白的表达筛选,成功获得hFIX转基因阳性细胞。【结论】pbCSN2-RC所含的牛β-酪蛋白启动子可以成功特异性诱导hFIX在猪乳腺细胞的特异表达,获得的hFIX转基因阳性猪胎儿成纤维细胞,为下一步通过体细胞克隆培育hFIX乳腺生物反应器奠定了基础。(本文来源于《中国农业科学》期刊2014年04期）
上官陶,张勃伟,孙薇薇,黄欣,张涌[5]（2011）在《溶葡萄球菌素基因乳腺特异表达载体的构建与检测及转基因核供体细胞的制备》一文中研究指出本研究旨在构建溶葡萄球菌素基因牛乳腺特异表达载体(pEPB),转染牛胎儿成纤维细胞,为制备溶葡萄球菌素基因的转基因克隆牛提供核供体细胞。本研究以pEGFP-C1为载体骨架,通过PCR扩增牛2.6kb的β-酪蛋白5′调控区及0.6kb的3′侧翼区(poly A)序列作为调控序列,制备成含有绿色荧光和新霉素筛选标记的牛乳腺特异表达载体,经PCR和酶切鉴定正确后,用转染试剂FuGene HD反复转染牛pEPB乳腺上皮细胞3～5次,用催乳素诱导后,经免疫荧光分析,检测目的蛋白的表达。然后,用电转染法转染牛胎儿成纤维细胞,经G418筛选得到阳性细胞后,把阳性细胞扩大培养并提取其基因组,因为溶葡萄球菌素基因是外源基因,经PCR及Southern blot检测来确定目的基因是否已经整合到细胞的基因组上。结果表明,溶葡萄球菌素基因在牛乳腺细胞中得到了表达,并整合到牛胎儿成纤维细胞的基因组中,得到了转溶葡萄球菌素基因的核供体细胞。结果显示,本研究所获得的转基因牛胎儿成纤维细胞可作为体细胞核移植的供体细胞进行转基因克隆牛研究。(本文来源于《畜牧兽医学报》期刊2011年10期）
周杨[6]（2011）在《重组人酸性成纤维细胞生长因子乳腺特异表达载体的构建及其功能的验证》一文中研究指出人酸性成纤维细胞生长因子(FGF1)在多种生物进程中都发挥重要作用,如胚胎发育、细胞生长和分化、形态发生、组织修复等,FGF1以其广泛的生物功能被认为是一种重要的用于治疗多种疾病的蛋白药物。本研究的目的是构建一个FGF1乳腺特异表达载体,用来以后制作FGF1乳腺反应器,从而在转基因牛奶中大量生产FGF1蛋白来满足临床需要。本实验中,我们构建了FGF1乳腺特异表达载体,并且在人的乳腺癌细胞系(MCF-7)中验证了该载体的功能。该载体转染MCF-7细胞后,通过EGFP和puro双重筛选得到细胞克隆,并对细胞克隆进行RT-PCR和western blot分析和细胞增殖测试。表明该载体能够成功的表达人FGF1蛋白,并且表达的蛋白具有促细胞增殖的活性。为了以后制作无筛选标记的转基因动物,我们将两个同向的loxP位点插入到了标记基因(EGFP和puro)的两侧。经EGFP和puro筛选得到的细胞系,在转入Cre重组酶表达载体后,loxP位点间的标记基因被删除,通过FACS系统分析发现转染后EGFP阳性细胞的比例降低,验证了该载体可用于标记基因的删除。此外,在FGF1基因两侧引入了突变的lox位点,用于Cre介导的交换系统。将获得的表达FGF1的细胞系同时转入Cre表达载体和含有tdTomato基因的置换载体,经荧光显微镜观察到呈现红色荧光的细胞,证明tdTomato基因可以通过Cre介导的交换系统替换FGF1基因,说明该载体可以通过Cre介导的交换作用来制作其他基因的乳腺反应器。(本文来源于《吉林大学》期刊2011-05-01）
袁玉国,安礼友,杨廷佳,于宝利,赵俊辉[7]（2010）在《含双筛选基因的人乳铁蛋白乳腺特异表达载体的构建及其表达》一文中研究指出为提高表达构件的表达水平和表达稳定性,采用CMV组成型启动子和牛αs1-CSN基因调控元件组成双启动子调控元件.为检验其表达状况,在上述调控元件中插入hLF cDNA,组成重组构件pbCNCS/LF36,为便于后续体细胞转基因克隆研究筛选出整合克隆细胞,在pbCNCS/LF36后方增加一个Cre/LoxP-GFP-Neo系统构建成pAPLM.构件pbCNCS/LF36经微注射导入ICR小鼠受精卵中并移入受体,构件pAPLM转染胎儿成纤维细胞筛选阳性细胞.结果pbCNCS/LF36构件受体妊娠率28.5%,产仔32个,PCR整合检测4只阳性(3♀,1♂,整合率12.5%);整合阳性小鼠和正常小鼠交配,对F1代检测发现,公鼠所产生后代PCR整合检测均呈阴性,此公鼠为假阳性.构件产生的3只母鼠和4#后代母鼠在泌乳时,对乳汁作ELISA检测hLF,结果均呈阳性,经半定量测定,3只原代母鼠表达量分别为3.8、2.8、0.9 mg/mL,4#后代3只母鼠表达量分别为4.2、3.9、3.6 mg/mL.构件pAPLM片段导入体外培养的山羊胎儿成纤维细胞,经G418筛选后,挑取单克隆扩大培养,提取细胞基因组DNA进行PCR检测,筛选到8株阳性克隆细胞,通过荧光显微镜观察100%的细胞都有GFP的表达.以上结果证实,pbCNCS/LF36采用双启动子均能在乳腺中特异高水平表达hLF,增加的Cre/LoxP-GFP-Neo系统能表达双标记基因,可提高筛选阳性供核细胞的准确性,这为进一步作体细胞转基因克隆奠定了基础.(本文来源于《中国畜牧兽医学会2010年学术年会——第二届中国兽医临床大会论文集(下册)》期刊2010-08-15）
马馨,宋光启,陈玥,张鹏,李子义[8]（2010）在《高赖氨酸基因乳腺特异表达载体的构建及其转染奶牛胎儿成纤维细胞的研究》一文中研究指出赖氨酸是大多数谷物的第一限制性氨基酸。对于人类来说,长期食用谷物必然导致赖氨酸的缺乏,造成人体所需氨基酸之间的不平衡,导致代谢紊乱、机体抵抗力下降等。因此,寻找高赖氨酸外源蛋白,补充赖氨酸摄入量的不足,对于机体必需氨基酸的平衡是非常重要的。本实验分别选取牛奶中富含赖氨酸的数种蛋白,将其富含赖氨酸的基因片段拼接在一起形成编码高含量赖氨酸的基因片段,人工合成全长376bp的高赖氨酸基因(HL),插入载体pBluescriptⅡSK(+)中,构建中间载体pBluescriptIISK(+)-HL(3331bp);对该质粒进行酶切鉴定后,得到376bp和2955bp两个片段,回收376bp高赖氨酸基因片段;去磷酸化后,连入乳腺特异表达载体PBC1的多克隆位点,并在载体和片段上分别设计方向鉴定引物检测高赖氨酸基因与载体的连接方向;以PGK-NEO为模板,克隆出真核细胞筛选标记新霉素抗性基因(neo),并将其插入高赖氨酸基因乳腺特异表达载体(PBC1-HL);取50日龄左右的遗传背景清楚的荷斯坦奶牛胎儿,将胎儿材料在70%乙醇中浸洗消毒后剥除胎膜,在DPBS溶液中洗2遍,在超净工作台中去除头、四肢以及内脏部分,在100mm培养皿中将其剪碎,利用胰酶消化,DMEM/high.glucose+10%FBS、38.5℃、5%CO2中培养,冷冻保存备用;利用分离的原代胎儿成纤维细胞,将G418浓度在200-750μg/mL范围内分12个梯度对G418最小致死剂量进行测定,记录G418不同浓度下细胞被全部杀死的天数,以12-14天杀死全部细胞的G418浓度作为最佳筛选浓度;利用fugene HD将线性化的高赖氨酸乳腺特异表达载体转染第二代奶牛胎儿成纤维细胞,并添加G418筛选稳定整合有目的基因的转基因细胞克隆,挑取单细胞克隆,以维持浓度继续筛选;最后获得的转基因细胞克隆,利用PCR的方法对各调控元件及目的基因进行检测。结果表明:获得连有高赖氨酸基因的中间载体pBluescriptⅡSK(+)-HL(3331bp);通过PCR检测及测序分析证明得到了目的基因插入方向正确并连入真核细胞筛选标记neo基因的乳腺特异表达载体PBC1-neo-HL(23.6Kb);通过对本实验分离的原代胎儿成纤维细胞G418最小致死剂量的测定,确定450μg/mL作为转基因细胞克隆的最佳筛选浓度,以200μg/mL作为维持浓度;通过G418筛选,获得转基因单细胞克隆44个,其中生长状态良好并鉴定为阳性的细胞克隆为7株。本实验构建的高赖氨酸基因乳腺特异表达载体及获得的转基因细胞克隆为下一步制作转基因小鼠及通过体细胞核移植技术生产转基因克隆奶牛提供了高效的表达载体及优秀的核供体细胞。(本文来源于《中国畜牧兽医学会动物解剖学及组织胚胎学分会第十六次学术研讨会论文集》期刊2010-08-10）
田甜,寨鸿瑞,刘若余[9]（2009）在《表达人溶菌酶基因牛乳腺特异表达载体的构建》一文中研究指出利用高保真PCR法,分别扩增了牛乳腺酪蛋白基因的1.8kb和1.1kb的5’和3’调控序列,克隆入TA载体。经测序鉴定后,利用DNA重组技术依次亚克隆入改造过的真核表达载体pcDNA3(切除CMV启动子),并插入人溶菌酶基因(hLYZ)的cD-NA,构建成牛乳腺特异表达载体。获得的重组载体经限制性内切酶酶切鉴定、PCR验证等表明,成功克隆了酪蛋白基因5’和3’的调控区,并成功构建了表达人溶菌酶基因的牛乳腺特异表达载体。(本文来源于《生物技术》期刊2009年03期）
刘茵,颜景斌,王强,方彧聃,潘树标[10]（2007）在《人血小板生成素基因乳腺特异表达载体的构建和表达》一文中研究指出目的为了获得能在转基因动物乳汁中高效表达人血小板生成素(TPO)的特异表达载体。方法将山羊β-乳球蛋白基因5′端上游-3.9kb和-1.9kb调控序列及β-酪蛋白启动子分别与人TPO基因连接,构建了pB3.9T、pB1.9T和pPT3个乳腺特异表达载体。将上述载体分别进行瞬间转染和稳定整合筛选实验,从mRNA及蛋白水平检测TPO基因的表达。结果BLG3.9、BLG1.9和P1A33种调控元件都可以启动人TPO在乳腺细胞中特异表达。瞬时转染时3种载体表达水平依次为pPT>pB3.9T>pB1.9T。但当外源基因稳定整合入细胞基因组后,TPO表达量持续升高,且pB3.9T表达量明显超过另外两种载体。结论证实了BLG转录子去阻遏和激活转变调节的存在,可能在其5′端-3.9kb与-1.9kb之间存在这一调节区域。并且与BLG1.9相比,BLG3.9能更有效地启动人TPO基因在乳腺细胞中的表达,也说明在-3.9至-1.9kb之间可能存在特殊的增强序列。(本文来源于《医学分子生物学杂志》期刊2007年04期）
乳腺特异表达载体构建论文开题报告
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
乳腺生物反应器具有广阔的开发前景,而提高目的基因的表达量是该领域一个重要的研究课题。因此,选用强的非特异性启动子pCAG,而不是乳腺特异性启动子来实现高效表达;通过Cre/loxP系统和山羊β-乳球蛋白启动区(pBLG)表达Cre重组酶来实现载体的自删除以达到乳腺特异表达的目的。方法:构建含PolyA终止信号的Cre乳腺特异表达元件PolyA-pBLG-cre,插至强启动子pCAG驱动的报告基因lacZ表达载体中,构建成乳腺特异表达载体pCBCZ(pCAG-loxPPolyA-pBLG-cre-loxP-lacZ)。转染细胞实验结果:PCR鉴定确认pCBCZ载体在小鼠乳腺上皮细胞(HC11)中发生Cre-loxP同源重组。X-Gal染色表明载体能驱动lacZ在HC11细胞中高效表达β-半乳糖苷酶,而在NIH 3T3细胞中仅少量表达。结论:构建的pCBCZ载体能高效驱动外源基因在乳腺细胞中表达,且具有较好的乳腺特异性,为研发乳腺生物反应器表达载体提供新的方法。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
乳腺特异表达载体构建论文参考文献
[1].庞礴,于鸿浩,张湑泽,谢玲,付林.高原鼠兔瘦素蛋白乳腺特异表达载体的构建及细胞表达[J].兽类学报.2019
[2].张斯敏,高越,方彧聃,张金脉,张敬之.乳腺生物反应器特异高效表达载体的构建[J].中国生物工程杂志.2014
[3].安辰瑞,李咏乐,詹俐楠,王春生,朴善花.乳腺特异的甜味蛋白Brazzein基因真核表达载体的构建[J].黑龙江畜牧兽医.2014
[4].韩雪洁,萨日娜,梁浩,李雪玲,李荣凤.人凝血因子Ⅸ乳腺特异表达载体的构建及细胞转染[J].中国农业科学.2014
[5].上官陶,张勃伟,孙薇薇,黄欣,张涌.溶葡萄球菌素基因乳腺特异表达载体的构建与检测及转基因核供体细胞的制备[J].畜牧兽医学报.2011
[6].周杨.重组人酸性成纤维细胞生长因子乳腺特异表达载体的构建及其功能的验证[D].吉林大学.2011
[7].袁玉国,安礼友,杨廷佳,于宝利,赵俊辉.含双筛选基因的人乳铁蛋白乳腺特异表达载体的构建及其表达[C].中国畜牧兽医学会2010年学术年会——第二届中国兽医临床大会论文集(下册).2010
[8].马馨,宋光启,陈玥,张鹏,李子义.高赖氨酸基因乳腺特异表达载体的构建及其转染奶牛胎儿成纤维细胞的研究[C].中国畜牧兽医学会动物解剖学及组织胚胎学分会第十六次学术研讨会论文集.2010
[9].田甜,寨鸿瑞,刘若余.表达人溶菌酶基因牛乳腺特异表达载体的构建[J].生物技术.2009
[10].刘茵,颜景斌,王强,方彧聃,潘树标.人血小板生成素基因乳腺特异表达载体的构建和表达[J].医学分子生物学杂志.2007
论文知识图
