DNA交联损伤下的解旋机制研究

论文摘要

DNA是生物体最基本的过程。DNA分子每天都会受到许多元素攻击,这些攻击来源于细胞内部和外源因素,这些攻击使得DNA结构发生变化,往往导致生物体发生基因损伤,当DNA损伤修复机制未能完全修复损伤时,将会引起细胞癌变或者死亡。在细胞周期中,DNA链间交联（ICLs）是一种绝对闭锁的基因损伤,它会阻碍细胞的转录和复制,妨碍细胞周期的完成。细胞中存在的修复方式中有一种是特异性对ICLs敏感的信号通路,被称为范可尼贫血信号通路,该通路可以介导多种修复方式应对ICL损伤。目前已发现17中范可尼贫血症相关蛋白,它们都参与了ICLs损伤修复,其中FANCM蛋白除了参与范可尼贫血信号通路之外,它本身对于ICLs修复有着关键作用。FANCM/MHF复合蛋白的移位酶活性可介导ICLs修复的主要模式——复制叉横移——帮助复制叉跨过ICLs损伤位点从上游DNA转移到下游DNA。MCM解旋酶是目前发现哺乳动物中唯一与复制相关的六元环解旋酶,它仅在与Cdc45和GINS蛋白结合以后,填补六元环的缺口导致构象改变时,才可以激活MCM的解旋酶活性。本文将利用光交联剂Dig-TMP对细胞进行交联损伤研究DNA交联损伤下的解旋机制。本文以FANCM蛋白为主要研究对象,通过体内蛋白互作验证技术——免疫共沉淀和邻位连接技术来研究:ICLs相关移位酶FANCM与解旋所必需的解旋酶MCM之间的关系以及CMG复合体遇到ICLs时的开环机制。我们发现FANCM蛋白与CMG复合体中的MCM蛋白、Cdc45蛋白之间存在一个相互作用,而这个作用是依赖于ATR,只有被磷酸化的MCM2才能够与FANCM蛋白互作。令我们惊喜的是GINS复合蛋白从CMG复合体中掉落,进一步研究发现,FANCM蛋白和GINS蛋白不能同时与MCM蛋白和Dig-TMP相互作用。这表明当细胞遇到ICLs时会激活ATR,同时招募FANCM蛋白聚集在ICLs位点,被ATR磷酸化的MCM蛋白可与FANCM蛋白相互作用并挤掉GINS复合蛋白,打开CMG的闭环,从上游DNA转移到下游DNA,解链ICL下游DNA。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 本文所用英文缩写词表
• 第1章 绪论
•   1.1 基因损伤修复与癌症
•     1.1.1 DNA复制与损伤
•     1.1.2 DNA损伤修复
•   1.2 范可尼贫血信号通路（Fanconi animia pathway,FA pathway）
•     1.2.1 FA核心蛋白
•     1.2.2 移位酶FANCM
•     1.2.3 复制叉横移（Replication fork traversal）
•   1.3 微小染色体维持复合物 2-7（Minichromosome maintenance protein,MCM）
•     1.3.1 DNA复制复合体（Replisome architecture）——CMG复合体
•     1.3.2 解旋酶MCM复合体
•   1.4 本文构思
• 第2章 移位酶FANCM与DNA解旋酶MCM2-7 复合体之间相互作用
•   2.1 前言
•   2.2 实验部分
•     2.2.1 试剂与仪器
•     2.2.2 溶液的配制
•     2.2.3 细胞培养与处理
•     2.2.4 染色质的提取（Chromatin extraction）
•     2.2.5 免疫共沉淀技术（Co-Immunoprecipitation, Co-IP）
•     2.2.6 邻位连接技术（Proximity ligation assay,PLA）
•     2.2.7 蛋白质免疫印迹（Western Blotting,WB）
•   2.3 结果与讨论
•     2.3.1 ATR磷酸化MCM2S108是FANCM蛋白和MCM蛋白的相互作用所必需的
•     2.3.2 利用邻位连接技术对FANCM蛋白与MCM蛋白相互作用研究
•   2.4 小结
• 第3章 CMG复合体的开环机制的相关研究
•   3.1 前言
•   3.2 实验部分
•     3.2.1 试剂与仪器
•     3.2.2 溶液的配制
•     3.2.3 细胞培养与处理
•     3.2.4 染色质的提取（Chromatin extraction）
•     3.2.5 免疫共沉淀技术（Co-Immunoprecipitation,Co-IP）
•     3.2.6 邻位连接技术（PLA）
•     3.2.7 蛋白质免疫印迹（Western Blotting,WB）
•   3.3 结果与讨论
•     3.3.1 FANCM蛋白与MCM蛋白的互作与GINS的丢失
•     3.3.2 ATR调控的FANCM和MCM蛋白互作发生在ICLs损伤位点
•     3.3.3 GINS复合蛋白在ICLs处的丢失依赖于ATR和FANCM蛋白
•   3.4 小结
• 结论
• 参考文献
• 附录 攻读硕士学位期间所发表的学术论文
• 致谢

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 彭丝雨

导师: 黄静

关键词: 交联损伤,通路,蛋白质相互作用

来源: 湖南大学

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学

单位: 湖南大学

分类号: Q523

DOI: 10.27135/d.cnki.ghudu.2019.001095

总页数: 58

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