非洲猪瘟病毒CRISPR/Cas9敲除载体库的构建及初步应用

论文摘要

非洲猪瘟(ASF)是由非洲猪瘟病毒(ASFV)的引发的一种高度传染性疾病。我国将其列为一类疫病,而世界动物卫生组织(OIE)将其作为必须报告的一种动物流行病。CRISPR/Cas9系统最初被发现为天然微生物免疫机制以防止侵入病毒或其他遗传元件。该途径的适应性在于使用位点特异性DNA双链断裂实现有效的基因组编辑,使得天然CRISPR系统以非常高的准确度特异性编辑哺乳动物基因组。此前,研究人员在ASFV免疫佐剂,减毒疫苗,DNA疫苗和亚单位疫苗方面做了大量工作(p72,p30,p54和p12)。但不幸的是,临床试验表明,这些疫苗都没有提供良好的保护效率。最近的研究发现,建立非洲猪瘟病毒CRISPR/Cas9敲除技术平台将为开发非洲猪瘟基因缺失的有效活疫苗提供可能。本文针对非洲猪瘟病毒CRISPR/Cas9敲除载体库的构建及初步应用做了以下内容研究:1.克隆ASFV SY18毒株中CD2v、UK(DP96R)启动子,分别构建含不同启动子和eGFP报告基因重组载体。并将其转染至人胚肾细胞(293T)、猪肾细胞(PK15)、非洲绿猴肾细胞(Vero)和传代的猪肺泡巨噬细胞(IPAM)中观察启动子活性,进一步研究ASFVSY18株哺乳动物细胞中同一区域启动子特异性转录调控的特点和机制。2.针对CD2v蛋白合成五条KLH偶联的多肽,制备抵抗素合成肽及其抗体。为ASFV CD2v蛋白分子功能的研究及CD2v蛋白的机制研究提供了有用的工具。3.构建并筛选基于非洲猪瘟的49个基因的重组gRNA(向导RNA)表达质粒,建立ASFV基因组CRISPR敲除gRNA库,并针对P30基因的gRNA鉴定其切割效率和免疫活性,为后续针对该基因对非洲猪瘟制定相应的免疫防控策略奠定了基础。4.建立了一种针对SY18株P72基因发快速、准确的非洲猪瘟病毒分子检测方法,为我国非洲猪瘟疫情的快速确诊提供了必要的分子诊断工具。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第1章 前言非洲猪瘟病毒CRISPR/Cas9 敲除技术研究进展
•   1.1 研究背景
•   1.2 传统ASFV疫苗研究进展
•     1.2.1 灭活疫苗
•     1.2.2 亚单位疫苗
•     1.2.3 DNA疫苗
•     1.2.4 同源重组弱毒疫苗
•     1.2.5 细菌染色体组技术（bacterial artificial chromosome, BAC）
•   1.3 CRISPR/Cas9 敲除技术在ASFV疫苗研究中的应用
•     1.3.1 CRISPR/Cas9 敲除技术
•     1.3.2 CRISPR可以高效构建重组ASFV并易于重组病毒的纯化
•   1.4 pX330-ΔNLS1/2neoR载体构建以及稳定表达g RNA野猪肺细胞系建立
•     1.4.1 pX330-ΔNLS1/2neoR载体构建
•     1.4.2 稳定表达g RNA的野猪肺细胞系（wild boar lung cell line,WSL）建立
•   1.5 未来展望
• 第2章 非洲猪瘟病毒CD2v、UK基因同源重组载体构建并将启动子活性在部分哺乳动物细胞中的比较及CD2V多肽合成与抗体制备
•   2.1 引言
•   2.2 .材料
•     2.2.1 实验动物及细胞
•     2.2.2 实验试剂
•     2.2.3 实验仪器
•   2.3 方法
•     2.3.1 pCD2vLR-eGFP重组质粒构建
•       2.3.1.1 左右同源臂基因合成
•       2.3.1.2 引物设计
•       2.3.1.3 目的片段的PCR扩增与目的扩增片段的回收
•       2.3.1.4 融合PCR法连接CD2v左右同源臂与e GFP基因
•       2.3.1.5 酶切p UC19 载体
•       2.3.1.6 构建p CD2v LR-e GFP重组质粒
•     2.3.2 pUKLR-eGFP重组质粒构建
•       2.3.2.1.左右同源臂以酶切位点连接基因合成
•       2.3.2.2 引物设计
•       2.3.2.3 eGFP的 PCR扩增与目的扩增片段的回收
•       2.3.2.4 酶切基因合成质粒
•       2.3.2.5 构建p UKLR-eGFP重组质粒
•     2.3.3.pCD2vLR-eGFP及pUKLR-eGFP重组质粒在不同哺乳动物细胞中启动子活性比较
•       2.3.3.1 质粒抽提
•       2.3.3.2 细胞培养
•       2.3.3.3 细胞转染
•     2.3.4 CD2V蛋白少量多抗制备
•       2.3.4.1 抵抗素抗原肽的合成
•       2.3.4.2 抗多肽抗体的制备
•     2.3.5 用于免疫沉淀的pFlag-CD2v真核表达产物制备及多抗有效性鉴定
•       2.3.5.1 质粒抽提
•       2.3.5.2 细胞培养
•       2.3.5.3 细胞转染
•       2.3.5.4 Western blot鉴定多抗有效性
•   2.4 结果
•     2.4.1 pCD2vLR-eGFP及 p UKLR-eGFP重组质粒荧光显微镜下观察
•       2.4.1.1293 T细胞
•       2.4.1.2 PK15 细胞
•       2.4.1.3 Vero细胞
•       2.4.1.4 IPAM细胞
•     2.4.2 FACS计数统计阳性细胞转染率
•       2.4.2.1293 T细胞FACS计数
•       2.4.2.2 PK15 细胞FACS计数
•       2.4.2.3 Vero细胞FACS计数
•       2.4.2.4 IPAM细胞FACS计数
•     2.4.3 CD2v多抗Western Blot鉴定结果
•   2.5 讨论
•   2.6 小结
• 第3章ASFV基因组CRISPR敲除g RNA库载体构建以及P30 基因g RNA活性效率验证
•   3.1 引言
•   3.2 材料
•     3.2.1 实验细胞
•     3.2.2 实验试剂
•     3.2.3 实验仪器
•   3.3 方法
•     3.3.1 靶位点g RNA的设计
•     3.3.2 g RNA退火
•     3.3.3 酶切去除NLS元件的p X335 载体
•     3.3.4 连接退火产物和PX335 酶切产物
•     3.3.5 重组质粒转化筛选
•     3.3.6 Lenti-P30 慢病毒包装
•     3.3.7 慢病毒感染 293T细胞
•     3.3.8 P30 慢病毒western blot鉴定
•     3.3.9 P30 蛋白CRISPR免疫学验证
•       3.3.9.1 P30sg RNA与lenti-P30 质粒转染免疫学验证
•       3.3.9.2 P30 sg RNA转染后P30 慢病毒感染免疫学验证
•   3.4 结果
•     3.4.1 P30 sg RNA载体构建结果
•     3.4.2 P30 慢病毒western blot鉴定结果
•     3.4.3 P30 sg RNA与lenti-P30 质粒转染Western blot验证结果
•     3.4.4 P30 sg RNA转染后P30 慢病毒感染western blot验证结果
•   3.5 讨论
•   3.6 小结
• 第4章 非洲猪瘟病毒Taq Man探针法荧光定量PCR检测方法建立
•   4.1 引言
•   4.2 材料
•     4.2.1 实验病毒
•     4.2.2 实验试剂
•     4.2.3 实验仪器
•   4.3 方法
•     4.3.1 标准质粒构建与引物设计
•     4.3.2 荧光定量PCR反应体系和反应条件
•     4.3.3 实时PCR的灵敏度测试和重复性测试
•     4.3.4 特异性试验
•   4.4 结果
•     4.4.1 PCR结果
•     4.4.2 染料法荧光定量PCR标准曲线和熔解曲线
•     4.4.3 Taq Man探针法q PCR的灵敏度与重复性检测
•     4.4.4 特异性试验
•   4.5 讨论
•   4.6 小结
• 参考文献
• 中英文对照缩略表
• 致谢
• 作者简介

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 任名

导师: 邬静,陈鸿军

关键词: 分子检测,多抗

来源: 湖南农业大学

年度: 2019

分类: 基础科学,农业科技

专业: 生物学,畜牧与动物医学

单位: 湖南农业大学

分类号: S852.651

DOI: 10.27136/d.cnki.ghunu.2019.000095

总页数: 68

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