毕赤酵母启动子及内部核糖体进入位点（IRES）的研究

论文摘要

毕赤酵母（pichia pastoris）由于具有生长快速、可高密度发酵、遗传操作简单和能进行翻译后修饰等特点,现已成为重要的工业微生物。毕赤酵母全基因组测序完成后,使得其应用不仅仅局限于作为外源蛋白的表达系统上,开始逐渐应用于合成生物学和代谢工程上。无论是用于外源蛋白表达还是合成生物学或代谢工程,基因表达元件的开发对于毕赤酵母系统的发展至关重要。基于这些,本研究从启动子和内部核糖体（IRES）元件入手,在毕赤酵母中筛选有功能的启动子和IRES元件。根据毕赤酵母转录组测序数据,分析在毕赤酵母中高转录基因,确定了18个候选基因,分别是ACO1、ALD4、ATO2、ATP1、ATP2、CIT1、CTA1、FDH1、HSP12、ICL1、OLE1、PCK1、POR1、QCR7、RGI2、SSA4、TDH3、TMA10。设计引物扩增这18个基因的拟启动子区,克隆到去除AOX1启动子的毕赤酵母pPICZA表达载体中。以Lac Z基因作为报告基因,分析了18个基因的拟启动子区的转录活性。结果显示,扩增的ALD4、ATP1、OLE1、PCK1、RGI2、SSA4、TDH3、TMA10基因拟启动子区具有较高的转录活性。与商用GAP启动子相比,扩增的ALD4、ATP1、OLE1、POR1、RGI2、SSA4、TDH3、TMA10基因拟启动子区转录活性分别高出311.7%、104.0%、187.0%、177.4%、266.3%、329.7%、218.2%、169.4%。对于微生物而言,碳源对代谢有很大影响。因此,分析了甘油、葡萄糖、甲醇、山梨醇四种碳源下ALD4、ATP1、ATP2、FDH1、OLE1、PCK1、POR1、RGI2、SSA4、TDH3、TMA10基因启动子的转录活性。结果显示ATP1在甘油碳源上转录水平最高,ALD4、RGI2、SSA4和TMA10在葡萄糖碳源上转录水平最高,ATP2、FDH1和TDH3在甲醇碳源上转录水平最高,OLE1、PCK1和POR1基因启动子在山梨醇碳源上转录水平最高。以EGFP为报告蛋白,分析了具有高转录活性的ALD4、ATP1、ATP2、FDH1、OLE1、PCK1、POR1、RGI2、SSA4、TMA10基因启动子的胞外表达情况,结果表明,ATP1、ATP2、FDH1、OLE1、RGI2、SSA4、TMA10基因启动子具有较高的表达水平,其中ATP1、ATP2、FDH1、RGI2、SSA4、TMA10基因的表达水平比商用GAP启动子分别高出303.3%、283.7%、250.0%、145.7%、233.3%、115.3%。以四种碳源分析显示,FDH1启动子与商用启动子AOX1相似,能被甲醇诱导。比较了FDH1与AOX1启动子在胞内和胞外的表达水平,结果表明,无论是用于胞内和胞外表达,FDH1启动子优于AOX1启动子,并且FDH1启动子不受甘油的抑制。不足的是FDH1在没有诱导之前有较高的本底表达。在IRES研究中,根据已有的研究,选取34个在哺乳动物、昆虫、植物或酿酒酵母中有功能的IRES序列。分别以EGFP和LacZ为报告基因,构建双顺反子报告载体对这34个IRES进行分析。研究发现,LacZ基因在无启动子的毕赤酵母表达载体中可进行转录,原因可能是载体骨架或LacZ基因含有隐含启动子。为了使LacZ基因可以用于本研究,利用β-半乳糖苷酶具有α互补特性,在毕赤酵母中建立了LacZ基因的α互补体系。将编码β-半乳糖苷酶N端1-92氨基酸序列放在双顺反子报告载体中表达,编码β-半乳糖苷酶C端整合到毕赤酵母GS115基因组中。经筛选,并排除隐含剪接位点、通读的可能,共得到7个在毕赤酵母中有功能的IRES序列,分别是TEV、PVY、RhPV、TRV-IGR、KSHV、crTMV病毒的IRES序列和酿酒酵母YPA1基因5’UTR序列。其中TEV和TRV-IGR的IRES活性最高。本研究所开发的启动子和IRES序列,进一步丰富了毕赤酵母系统基因表达元件,为多基因在毕赤酵母中的表达提供了更多的表达元件选择,有利于推动毕赤酵母系统的发展和完善。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 绪论
•   1 毕赤酵母概述
•   2 毕赤酵母用于代谢工程和合成生物学中应用研究进展
•   3 毕赤酵母启动子研究进展
•   4 内部核糖体进入位点（IRES）的研究进展
•   5 本研究的目的和意义
• 第一章 实验材料和方法
•   第一节 实验材料
•     1.1.1 菌株与质粒
•     1.1.2 主要仪器
•     1.1.3 主要试剂
•     1.1.4 常用培养基和缓冲液
•     1.1.5 寡聚核苷酸引物
•   第二节 实验方法
•     1.2.1 质粒的提取
•     1.2.2 液氮研磨法手提基因组
•     1.2.3 PCR反应
•     1.2.4 质粒酶切反应
•     1.2.5 载体和PCR产物纯化
•     1.2.6 连接反应
•     1.2.7 转化反应
•     1.2.8 山梨醇-电转化酵母细胞
•     1.2.9 毕赤酵母总RNA的提取
•     1.2.10 逆转录PCR
•     1.2.11 点突变
•     1.2.12 比色法测定β-半乳糖苷酶的活性
•     1.2.13 发酵产物的Western-blot检测
•     1.2.14 Real-time PCR检测
•     1.2.15 载体的构建
• 第二章 实验结果
•   第一节 毕赤酵母高表达启动子的筛选与功能研究
•     2.1.1 毕赤酵母候选基因的选择
•     2.1.2 候选基因启动子区克隆
•     2.1.3 用于启动子活性检测载体的构建和报告蛋白的选择
•     2.1.4 候选基因启动子功能验证
•     2.1.5 启动子在不同碳源中的活性
•     2.1.6 启动子胞外分泌表达水平
•     2.1.7 AOX1和FDH1 启动子胞内表达水平的比较
•     2.1.8 AOX1和FDH1 启动子胞外表达水平的比较
•   第二节 毕赤酵母中有功能IRES的筛选及研究
•     2.2.1 LacZ基因在毕赤酵母中可以驱动自身表达
•     2.2.2 β-半乳糖苷酶α互补体系在毕赤酵母中的建立
•     2.2.3 在毕赤酵母中具有功能IRES的筛选
•     2.2.4 双顺反子mRNA翻译中通读情况的排除
•     2.2.5 双顺反子mRNA中剪接情况的排除
• 第三章 分析与讨论
• 第四章 结论
• 参考文献
• 攻读学位期间承担的科研任务与主要成果
• 致谢
• 个人简历

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 张亚菲

导师: 黄义德

关键词: 毕赤酵母,启动子,外源表达,合成生物学

来源: 福建师范大学

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学,生物学

单位: 福建师范大学

分类号: Q933

DOI: 10.27019/d.cnki.gfjsu.2019.000533

总页数: 90

文件大小: 4901k

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