果糖基转移酶及D-甘露糖异构酶的固定化

论文摘要

低聚果糖和D-甘露糖两种功能糖均能有效增殖双歧杆菌,促进肠胃功能,年产量超过万吨。固定化酶技术凭借众多优点如提高酶的利用率、降低生产成本成为最具潜力的商业化生产方式。本课题利用实验室保藏的Aspergillus niger AS0023以及Bacillus subtilis SK48.001发酵培养获得粗酶粉,以不同载体分别固定化果糖基转移酶和D-甘露糖异构酶,探索固定化条件和酶学性质,为其工业应用提供理论依据。选择十种阴离子交换树脂和大孔吸附树脂为载体、戊二醛为交联剂,通过先吸附后交联的方法研究果糖基转移酶的固定化,筛选出固定化效果最好的弱碱性酚醛系阴离子交换树脂Duolite A568。固定化的最优条件为加酶量285 U/g树脂,24°C、pH 5.0吸附7h,于4°C冷却30 min,加入体积浓度为0.01%的戊二醛后4°C静置交联3 h,回收率为54.72%,酶活达到155.19 U/g树脂,是优化前的1.98倍。固定化酶的最适温度为60°C,较游离酶高10°C,但温度稳定性明显增强;最适pH为5.5,向酸性方向略有偏移;米氏常数为930.94 mmol/L,比游离酶高,说明对底物的亲和性有所下降;重复使用8次后,酶活仍能残余45%以上,表明载体Duolite A568的固定化性能良好。采用相同的十种树脂作为载体研究D-甘露糖异构酶的固定化,以强碱性苯乙烯系阴离子交换树脂Amberlite FPA90 Cl固定化效果最好。结果表明,最佳固定化条件为:加酶量26 U/g树脂,吸附pH 8.5,吸附温度为28°C,吸附4 h后,于4°C冷却30 min,加入交联剂至体系内戊二醛体积分数为0.04%,4°C下交联2 h,此时回收率可达70%以上,酶活达19.21 U/g树脂,较优化前提高了1.11倍。固定化酶的最适温度为45°C,最适pH 8.0,温度稳定性和pH稳定性都优于游离酶,米氏常数也比游离酶高。固定化酶在重复使用8次后仍保留80.8%的活性,表明该固定化酶具有较好的操作稳定性。通过化学沉淀法合成磁性Fe3O4纳米粒子,以壳聚糖为改性剂提高其生物相容性,获得壳聚糖包裹的磁性纳米粒子（Chitosan-coated magnetic nanoparticles,CS-MNPs）。以CS-MNPs作为载体固定化D-甘露糖异构酶,采用单因素法确定最佳固定化条件:加酶量为30 U/g载体,固定化pH 6.5,20°C恒温固定化2 h。固定化酶的最适温度为50°C,最适pH为7.5,重复反应6个批次后,酶活能保留26.19%,表明以壳聚糖包裹的磁性纳米粒子作为载体固定化D-甘露糖异构酶具有可行性。这种材料方便控制反应的起始与终止,对于实际生产中快速分离酶与反应混合物具有重要的意义,为后续的研究奠定了基础。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 绪论
•   1.1 功能糖的生物制备
•     1.1.1 低聚果糖和果糖基转移酶
•     1.1.2 D-甘露糖和D-甘露糖异构酶
•   1.2 固定化酶概述
•     1.2.1 固定化酶技术和方法
•     1.2.2 固定化载体的选择
•     1.2.3 固定化酶在食品工业中的应用
•   1.3 固定化果糖基转移酶和D-甘露糖异构酶的研究进展
•     1.3.1 果糖基转移酶固定化技术的研究进展
•     1.3.2 D-甘露糖异构酶固定化技术的研究进展
•   1.4 课题研究背景及意义
•   1.5 课题主要研究内容
• 2 材料与方法
•   2.1 实验材料和试剂
•     2.1.1 实验材料
•     2.1.2 主要试剂
•     2.1.3 实验仪器
•   2.2 实验方法
•     2.2.1 果糖基转移酶的制备
•     2.2.2 树脂固定化果糖基转移酶的筛选
•     2.2.3 树脂固定化果糖基转移酶的条件优化
•     2.2.4 树脂固定化果糖基转移酶的酶学性质及稳定性研究
•     2.2.5 D-甘露糖异构酶的制备
•     2.2.6 树脂固定化D-甘露糖异构酶的筛选
•     2.2.7 树脂固定化D-甘露糖异构酶的条件优化
•     2.2.8 树脂固定化D-甘露糖异构酶的酶学性质及稳定性研究
•     2.2.9 固定化材料CS-MNPs的制备
•     2.2.10 CS-MNPs的表征分析
•     2.2.11 CS-MNPs固定化D-甘露糖异构酶的条件优化
•     2.2.12 CS-MNPs固定化D-甘露糖异构酶的酶学性质及稳定性研究
• 3 结果与讨论
•   3.1 以树脂为载体固定化果糖基转移酶
•     3.1.1 树脂固定化果糖基转移酶的条件优化
•     3.1.2 树脂固定化果糖基转移酶的酶学性质及稳定性研究
•   3.2 以树脂为载体固定化D-甘露糖异构酶
•     3.2.1 树脂固定化D-甘露糖异构酶的条件优化
•     3.2.2 树脂固定化D-甘露糖异构酶的酶学性质及稳定性研究
•   3.3 以CS-MNPs为载体固定化D-甘露糖异构酶
•     3.3.0 CS-MNPs的制备
•     3.3.1 CS-MNPs的表征分析
•     3.3.2 CS-MNPs固定化D-甘露糖异构酶的条件优化
•     3.3.3 CS-MNPs固定化D-甘露糖异构酶的酶学性质及稳定性研究
• 主要结论与展望
• 致谢
• 参考文献
• 附录：作者在攻读硕士学位期间发表的论文

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 金辉

导师: 江波

关键词: 固定化,果糖基转移酶,甘露糖异构酶,树脂,磁性纳米粒子

来源: 江南大学

年度: 2019

分类: 基础科学,工程科技Ⅰ辑

专业: 生物学,一般化学工业

单位: 江南大学

分类号: TQ929

总页数: 56

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