毕赤酵母液滴微流控高通量筛选方法的建立与应用

论文摘要

巴斯德毕赤酵母是当前应用最为方便和广泛的外源蛋白表达系统之一,为了进一步提高其表达外源蛋白的能力,文中建立了基于液滴微流控的毕赤酵母高通量筛选方法,并以木聚糖酶融合荧光蛋白为例,筛选获得木聚糖酶表达和分泌能力提高的突变株。通过PCR扩增得到木聚糖酶xyn5基因和绿色荧光蛋白gfp基因融合片段,并克隆到毕赤酵母表达载体pPIC9K中构建出木聚糖酶融合绿色荧光蛋白的质粒pPIC9K-xyn5-gfp,电转化至毕赤酵母GS115中得到表达木聚糖酶和绿色荧光蛋白的毕赤酵母SG菌株。该菌株经过常压室温等离子体诱变后进行单细胞液滴包埋,液滴培养24 h后进行微流控筛选,获得高表达木聚糖酶的突变菌株,进而用于下一轮的诱变突变库构建和筛选。以此类推,经过5轮液滴微流控筛选,获得一株高产菌株SG-m5,其木聚糖酶活为149.17 U/mg,较出发菌株提升300%,分泌外源蛋白的能力较出发菌株提高160%。文中建立的毕赤酵母单细胞液滴微流控高通量筛选方法能达到每小时10万菌株的筛选通量,筛选百万级别的菌株库仅需10 h,消耗荧光试剂体积100μL,对比传统的微孔板筛选方法降低试剂成本近百万倍,为高效、低成本筛选获得表达和分泌外源蛋白能力提高的毕赤酵母提供了一条新途径。

论文目录

• 1 材料与方法
•   1.1 材料
•     1.1.1 菌株和质粒
•     1.1.2 培养基
•     1.1.3 主要试剂
•   1.2 方法
•     1.2.1 重组质粒的构建
•     1.2.2 毕赤酵母细胞的电击转化及诱导表达
•     1.2.3 液滴包埋方法
•     1.2.4 常压室温等离子体诱变方法
•     1.2.5 液滴微流控筛选
•     1.2.6 突变株摇瓶发酵
•     1.2.7 酶活检测
• 2 结果与分析
•   2.1 重组质粒的构建
•   2.2 重组质粒的转化与表达鉴定
•   2.3 液滴微流控筛选方法建立
•     2.3.1 单细胞液滴包埋条件优化
•     2.3.2 液滴内木聚糖酶的荧光检测
•     2.3.3 液滴培养时间的优化
•   2.4 ARTP诱变和突变体菌株库构建
•   2.5 突变菌株库的液滴微流控筛选
•   2.6 菌株分泌特性研究
• 3 讨论

文章来源

类型: 期刊论文

作者: 吕彤,涂然,袁会领,刘浩,王钦宏

关键词: 毕赤酵母,液滴微流控,高通量筛选,单细胞,外源蛋白表达,蛋白分泌

来源: 生物工程学报 2019年07期

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学

单位: 天津科技大学生物工程学院,中国科学院天津工业生物技术研究所中国科学院系统微生物工程重点实验室

基金: 中国科学院科技服务网络计划(No.KFJ-SW-STS-165),中国科学院科研装备研制项目(No.YJKYYQ20170023)资助~~

分类号: Q78

DOI: 10.13345/j.cjb.190058

页码: 1317-1325

总页数: 9

文件大小: 854K

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