磷脂酶D的重组优化表达及生物转化制备磷脂酰丝氨酸

论文摘要

磷脂酰丝氨酸（phosphatidylserine;PS）作为大脑中的主要酸性磷脂,具有提高认知力、抗压抑等功效,可用于医药、食品等领域。由于自然界中含量较少,且提取困难,近年来,人们开始关注酶转化法制备PS。即通过磷脂酶D（phospholipase D;EC 3.1.4.4;PLD）催化底物磷脂酰胆碱和L-丝氨酸合成。目前虽然取得了一定研究成果,但仍存在一些不足之处:（1）野生菌PLD分泌量远低于工业生产标准;（2）现有研究中PS多采用有机相和水相两相催化体系生成。基于此,本研究以Bacillus subtilis WB600为宿主,研究了PLD的异源高效表达,并优化了PS在纯水相中的生成条件。主要研究结果如下:（1）PLD的异源表达及信号肽优化。将Streptomyces racemochromogenes来源的PLD基因按照枯草芽孢杆菌密码子优化性合成,并根据N端带电荷数和H端疏水性选择了7条来源于枯草芽孢杆菌的信号肽,将其融在PLD基因N端,将这7段融合片段克隆到表达质粒pSTOP并转入B.subtilis WB600中表达,比较了不同信号肽牵引下的PLD分泌效率。结果显示,PLD在B.subtilis WB600中成功实现胞外异源分泌表达,且在信号肽amyE介导下获得最高胞外酶活11.3 U×mL-1,是内源性信号肽介导下胞外酶活分泌量的5.27倍,ywbN信号肽介导的胞外PLD酶活最低(3.2 U×mL-1)。（2）表达载体优化。分别构建了3个重组表达质粒pSTOP-PLD-amyE-his、pMA0911-PLD-amyE-his和pP43-PLD-amyE-his,包含这3个质粒的重组菌分别命名为STT1、ST2和ST3。结果显示,ST2和ST3的PLD酶活高于STT1,ST2菌株获得最高酶活19.1 U×mL-1,比对照提高约69.03%,通过对3株菌的胞外上清液进行Western Blot检测,在约53 kDa处均可见明显单一条带,与报道条带大小相符。（3）RBS及spacer区优化。通过RBS Calculator v2.0软件对重组质粒pMA0911-PLD-amyE-his的RBS及spacer区进行优化,选择了翻译效率较原始序列分别提高3、6、9、12倍的四种组合,分别得到RS1、RS2、RS3和RS4这4株重组菌。结果显示RS1菌株获得最高胞外酶活24.2 U×mL-1,较对照提高约26.7%,而RS4菌株胞外酶活反而较对照降低约11.8%。我们发现随着RBS强度的增加,PLD胞外分泌量呈现先升高后降低的趋势,这表明RBS的翻译强度并不明显与PLD的分泌量呈正相关。（4）15 L发酵罐实验及酶学性质研究。15 L发酵罐实验,酶活提高约5倍,达到116.2U×mL-1。对RS1菌株进行遗传稳定性实验,重组质粒经过5代后的保留率仍为100%。纯化RS1菌株的胞外上清液,测定PLD酶学性质。结果表明,PLD蛋白条带大小约为53 kDa,与已报道条带大小相符,最适反应温度45℃,最适反应pH 5.5,4℃下可长期保藏。（5）优化纯水相中生产PS工艺,避免了有机相的使用。最佳反应条件下:PC60:L-丝氨酸1:10(g×g-1)、酶添加量500 U、反应温度45℃、反应pH 5.5、反应时间6 h、氯化钙添加量10%。反应6 h后,以PC60为底物,PS转化率达到96.7%,PC剩余2.3%,副产物PA仅生成0.2%,底物向产物实现高效转化。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 符号缩写
• 第一章 绪论
•   1.1 磷脂酶D及其催化机理
•     1.1.1 磷脂酶D功能及序列
•     1.1.2 磷脂酶D结构
•     1.1.3 磷脂酶D反应催化机理
•   1.2 磷脂酶D异源表达研究
•     1.2.1 磷脂酶D在大肠杆菌中表达
•     1.2.2 磷脂酶D在枯草芽孢杆菌中表达
•     1.2.3 磷脂酶D在链霉菌中表达
•     1.2.4 磷脂酶D在酵母中表达
•   1.3 枯草芽孢杆菌的简介
•     1.3.1 影响表达的原件
•     1.3.2 启动子
•     1.3.3 非翻译区
•     1.3.4 信号肽
•   1.4 磷脂酰丝氨酸简介
•     1.4.1 磷脂酰丝氨酸的分子结构和性质
•     1.4.2 磷脂酰丝氨酸的功能
•     1.4.3 磷脂酰丝氨酸的制备方法
•   1.5 本研究的意义和内容
• 第二章 材料与方法
•   2.1 实验材料
•     2.1.1 菌株和质粒
•     2.1.2 培养基和培养条件
•     2.1.3 试剂和仪器
•   2.2 实验方法
•     2.2.1 DNA操作
•     2.2.2 不同信号肽载体构建
•     2.2.3 不同载体选择
•     2.2.4 RBS及 spacer区优化
•     2.2.5 目的基因测序
•     2.2.6 磷脂酶D的表达
•     2.2.7 重组菌遗传稳定性实验
•     2.2.8 15L罐发酵放大
•     2.2.9 磷脂酶D同源建模
•   2.3 分析方法
•     2.3.1 磷脂酶D酶活测定
•     2.3.2 SDS-PAGE电泳检测
•     2.3.3 计算生物学分析RBS强度
•     2.3.4 蛋白浓度检测
•     2.3.5 Western blot分析
•     2.3.6 液相检测产物方法
•   2.4 磷脂酶D的纯化及酶学性质分析
•     2.4.1 粗酶液的纯化
•     2.4.2 磷脂酶D酶学性质研究
•     2.4.3 磷脂酶D的保藏
•   2.5 磷脂酰丝氨酸生成条件优化
•     2.5.1 优化底物质量比
•     2.5.2 优化缓冲液pH
•     2.5.3 优化反应温度
•     2.5.4 优化反应时间
•     2.5.5 优化酶添加量
•     2.5.6 优化盐离子种类
•     2.5.7 优化盐离子浓度
• 第三章 结果与讨论
•   3.1 PLD的异源表达及信号肽优化
•     3.1.1 目的基因的选择及密码子优化
•     3.1.2 信号肽序列及特征
•     3.1.3 N端融合信号肽菌株的构建及转化
•     3.1.4 信号肽优化重组菌中磷脂酶D的表达
•   3.2 表达载体、RBS及 SPACER区优化
•     3.2.1 不同重组表达载体的构建
•     3.2.2 不同重组表达载体菌株产磷脂酶D验证
•     3.2.3 RBS及 spacer区的选择
•     3.2.4 RBS及 spacer区对磷脂酶D分泌的影响
•   3.3 重组菌的遗传稳定性及15L罐发酵放大实验
•     3.3.1 重组菌的遗传稳定性
•     3.3.2 15L罐发酵放大
•   3.4 酶学性质研究
•     3.4.1 磷脂酶D同源建模
•     3.4.2 磷脂酶D的纯化
•     3.4.3 磷脂酶D的最适反应温度及温度稳定性
•     3.4.4 磷脂酶D的最适反应pH及 pH稳定性
•     3.4.5 金属离子对磷脂酶D稳定性影响
•     3.4.6 有机试剂对磷脂酶D稳定性影响
•     3.4.7 磷脂酶D的保藏
•   3.5 磷脂酰丝氨酸生成条件优化
•     3.5.1 磷脂酰丝氨酸的液相检测分析
•     3.5.2 底物质量比的优化
•     3.5.3 缓冲液pH的优化
•     3.5.4 反应温度的优化
•     3.5.5 反应时间的优化
•     3.5.6 酶添加量对PLD酶活的影响
•     3.5.7 盐离子种类的优化
•     3.5.8 氯化钙浓度的优化
• 主要结论与展望
•   主要结论
•   展望
• 致谢
• 参考文献
• 附录Ⅰ：作者攻读学术硕士期间发表的论文
• 附录Ⅱ：PLD优化前后序列对比

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 黄婷婷

导师: 刘龙

关键词: 磷脂酶,磷脂酰丝氨酸,枯草芽孢杆菌,分泌表达

来源: 江南大学

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学,生物学

单位: 江南大学

分类号: Q78;Q55

总页数: 64

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