靶向猪PSP基因的CRISPR/Cas9系统sgRNA筛选

论文摘要

CRISPR/Cas9技术是一种新的基因编辑技术,随着近几年对CRISPR/Cas9的结构和工作原理研究,CRISPR/Cas9已经被成功应用于畜牧生产、疾病治疗、器官移植、环境保护、药品研发、基因功能研究等领域。猪腮腺分泌蛋白（Parotid Secretory Protein,PSP）基因位于猪的17号染色体,能够在腮腺中大量表达。腮腺作为外分泌器官其分泌的蛋白具有组织特异性强、表达蛋白种类少、分泌量大、不受性别和发育时期影响、容易收集提纯等优点,使得腮腺作为生物反应器具有巨大研究潜力。虽然已有利用腮腺特异性表达外源基因的转基因猪研究,但是大多是利用传统转基因技术,存在外源基因随机整合、整合效率低,遗传稳定性、表达稳定性差、不同转基因系间由于外源基因整合拷贝数、整合位点以及整合方式的不同其表达水平差异很大等问题。通过基因打靶将外源基因与内源基因通过2A序列或IREs序列连接,使外源基因在完整的内源基因调控原件调控下以单拷贝形式进行表达,这即保证了内源基因的正常表达,又同时解决了传统转基因技术存在的上述问题。本研究旨在以猪的PSP基因为模型,建立利用CRISPR/Cas9系统对猪PSP基因定点整合的方法体系,筛选出靶向猪PSP基因具有高敲入活性的sgRNA,并分析CRISPR/Cas9对PSP基因整合的脱靶效应,为实现上述类型转基因猪制备奠定基础。实验首先通过检索NCBI的基因库,获得猪PSP基因的cDNA序列。利用Zhang Lab在线sgRNA设计网站筛选出5对靶向猪PSP基因的sgRNA序列,并构建出相应的sgRNA表达质粒载体。以载体质粒为模板进行PCR扩增sgRNA体外转录模板并纯化,再利用sgRNA体外转录试剂盒,转录出相应的sgNRA。以猪基因组DNA为模板进行PCR扩增体外切割底物并纯化。将Cas9体外酶切试剂盒中Cas9蛋白、体外切割底物、sgRNA混合按Cas9体外酶切试剂盒说明书进行孵育,用1%的琼脂糖凝胶电泳观察检测切割效率。体外酶切电泳结果显示:sgRNA1、sgRNA3、sgRNA4和sgRNA5均可以引导Cas9蛋白将体外切割底物切割成两段,说明sgRNA1、sgRNA3、sgRNA4和sgRNA5具有较高的引导Cas9蛋白体外酶切活性,可用于打靶实验;sgRNA2未能将体外切割底物切开,说明sgRNA2不具有引导Cas9蛋白体外酶切活性。利用筛选出靶向PSP基因体外酶切活性较高的sgRNA,构建sgRNA和Cas9共表达载体pCas9-sgRNA。以猪基因组DNA为模板进行PCR扩增打靶载体的上下游同源臂部分,利用限制性内切酶MluⅠ和XhoⅠ切割pCMV-NeoR-bGH质粒获得新霉素抗性基因（neomycin resistance gene,NeoR）表达结构,将NeoR表达结构和上下游同源臂连接构建打靶载体pMD19-5′arm-NeoR-3′arm。将sgRNA和Cas9共表达载体和打靶载体共转染猪肾细胞（PK-15细胞）,利用G418进行筛选后,采用无限稀释法分离单细胞克隆。通过PCR扩增及测序鉴定NeoR定点敲入阳性单克隆细胞。结果显示:用sgRNA1作为指导的sgRNA筛选到的22株细胞克隆中有5株为阳性单克隆细胞,打靶效率为22.7%;用sgRNA3作为指导的sgRNA筛选到的24株细胞克隆中12株为阳性单克隆细胞,打靶效率为50.0%;用sgRNA4作为指导的sgRNA筛选到的19株细胞克隆中有8株为阳性单克隆细胞,打靶效率为42.1%;用sgRNA5作为指导的sgRNA筛选到的23株细胞克隆中有6株为阳性单克隆细胞,打靶效率为26.1%。为了进一步对筛选到的阳性单克隆细胞进行潜在脱靶位点分析,利用sgRNA在线设计软件CCTop对筛选到的sgRNA进行在线分析,各选出5个脱靶可能性高的潜在脱靶位点,设计引物以阳性单克隆细胞为模板进行PCR扩增和测序。结果显示:sgRNA1作引导sgRNA的5个潜在脱靶位点中第1个潜在脱靶位点sgRNA1-1发生了脱靶效应;sgRNA3作引导sgRNA的5个潜在脱靶位点均未发生脱靶效应;sgRNA4作引导sgRNA的5个潜在脱靶位点均未发生脱靶效应;sgRNA5作引导sgRNA的5个潜在脱靶位点中第5个潜在脱靶位点sgRNA5-5发生了脱靶效应。综上,通过体外筛选、打靶实验和脱靶分析最终筛选出2对高效引导外源基因定点敲入猪PSP基因的sgRNA（sgRNA3和sgRNA4）,成功建立针对猪PSP基因进行基因编辑的方法体系,为深入研究转基因猪提供了基础资料。

论文目录

• 摘要
• abstract
• 1 引言
•   1.1 转基因技术在猪育种中的应用
•     1.1.1 提高生产性能和改善产品品质
•     1.1.2 提高抗病能力
•     1.1.3 异体器官移植
•     1.1.4 动物疾病模型
•     1.1.5 生物反应器
•     1.1.6 降低环境污染
•   1.2 CRISPR/Cas9 系统的研究进展
•     1.2.1 CRISPR/Cas分类
•     1.2.2 CRISPR/Cas9 结构
•     1.2.3 CRISPR/Cas9 作用原理
•     1.2.4 脱靶效应影响因素
•     1.2.5 降低脱靶效应方法
•     1.2.6 CRISPR/Cas9 系统的应用
•   1.3 腮腺分泌蛋白研究进展
•     1.3.1 腮腺分泌蛋白的研究
•     1.3.2 腮腺生物反应器
•   1.4 实验目的和意义
• 2 材料与方法
•   2.1 材料
•     2.1.1 细胞
•     2.1.2 质粒与菌株
•     2.1.3 实验用试剂来源
•     2.1.4 相关溶液配制
•     2.1.5 主要分析软件
•     2.1.6 主要设备和仪器
•   2.2 实验方法
•     2.2.1 E.coli DH5α感受态的制备
•     2.2.2 靶向猪PSP基因的sgRNA设计与合成
•     2.2.3 sgRNA体外转录载体的构建
•     2.2.4 sgRNA体外转录与纯化
•     2.2.5 体外切割底物的PCR扩增与纯化
•     2.2.6 sgRNA体外活性检测
•     2.2.7 sgRNA和 Cas9 共表达载体p Cas9-sg RNA的构建
•     2.2.8 打靶载体pMD19-5′arm-3′arm的构建
•     2.2.9 PK-15 细胞培养
•     2.2.10 转染PK-15 细胞和阳性单克隆细胞筛选
•     2.2.11 Neo R定点敲入单克隆细胞系的鉴定
•     2.2.12 脱靶效应位点分析
• 3 结果与分析
•   3.1 sgRNA体外活性鉴定
•     3.1.1 sgRNA体外转录载体的构建
•     3.1.2 sgRNA转录与纯化
•     3.1.3 体外切割底物的PCR扩增与纯化
•     3.1.4 sgRNA体外活性鉴定
•   3.2 NeoR定点整合细胞系的获得
•     3.2.1 sgRNA和 Cas9 共表达载体的构建
•     3.2.2 打靶载体的构建
•     3.2.3 细胞转染和单克隆细胞筛选
•     3.2.4 Neo R定点整合细胞系的鉴定
•   3.3 潜在脱靶位点鉴定
• 4 讨论
• 5 结论
• 参考文献
• 在读期间发表的论文
• 作者简历
• 致谢
• 附件

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 靳伟

导师: 樊宝良

关键词: 基因,体外转录,脱靶效应

来源: 河北农业大学

年度: 2019

分类: 基础科学,农业科技

专业: 生物学,畜牧与动物医学

单位: 河北农业大学

分类号: Q78;S828

总页数: 64

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