苜蓿CIPK基因的克隆与功能研究

论文摘要

紫花苜蓿（Medicago sativa.）是在国内大范围种植的牧草,具有产量高,品质好,适应性好等优点。Ca2+是植物逆境胁迫下的主要调控因子,而CBL/CIPK信号调控系统对Ca2+起很大的调控作用。因此本研究利用分子生物学技术对苜蓿CIPK基因进行研究。本研究利用对实验室现存的CIPK基因功能缺失突变体（cipk3、cipk5、cipk11、cipk18、cipk21）进行筛选,将具有高度敏感表型的CIPK3基因列为主要研究的基因。蒺藜苜蓿与紫花苜蓿的高度同源性（99%）且为模式植物,本研究主要研究了蒺藜苜蓿R108的CIPK3基因。利用同源序列比对法获得蒺藜苜蓿CIPK3基因序列,采用生物信息学相关技术对CIPK3基因进行蛋白组学及功能分析;以此为基础,探究CIPK3基因在不同胁迫（高盐胁迫、干旱胁迫及ABA胁迫）下的表达水平,本试验采用了实时荧光定量（qRT-PCR）技术来进行分析;构建蒺藜苜蓿R108 CIPK3基因的功能过表达载体2×35 Sp CAMBIA1300-CIPK3,通过农杆菌介导法转化拟南芥成功获得了CIPK3基因过表达的植株,随后运用转基因拟南芥来进行初步功能的研究。主要研究结果如下:1.蒺藜苜蓿CIPK3基因的cDNA全长为1293 bp,编码430个氨基酸残基。信号肽预测结果显示CIPK3基因编码蛋白内不含有信号肽,存在两个跨膜结构域,主要定位于细胞质,推测其为在细胞质中行使功能的非分泌蛋白,并且与鹰嘴豆、大豆、百脉根、豇豆等豆科植物亲缘关系较近,而与拟南芥、苹果、玉米、小麦、水稻等植物的亲缘关系较远。2.蒺藜苜蓿CIPK3基因在植株的根和叶片中均有一定量的表达,且在叶片中的相对表达量是在根中的3.84倍。当受到高盐胁迫、干旱胁迫及ABA胁迫时,CIPK3基因在植株的各部位的表达水平都表现出一定量的上调,并且表达水平会根据胁迫处理时间的不同发生相应的变化。在受到ABA胁迫时,CIPK3基因的相对表达水平的上升幅度最大,高盐胁迫其次,干旱胁迫时变化幅度最小。3.通过筛选得到转CIPK3基因拟南芥的T3代植株后,对其进行高盐胁迫处理,以野生型为对照观察表型,验证CIPK3基因在胁迫环境下的功能。结果发现,CIPK3基因对种子萌发有积极作用,且植株的根长存在显著差异,初步推测其通过维持植株体内正常的离子平衡来维持植物正常生长。综上所述,本研究最终验证了蒺藜苜蓿CIPK3在植物受到非生物胁迫时能显著地提高植物的抗逆性,为后期研究抗逆性强的紫花苜蓿打下了基础。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 文献综述
•   1.1 CBL/CIPK信号系统
•     1.1.1 CBL蛋白家族的结构
•     1.1.2 CIPK蛋白家族的结构及特点
•   1.2 CBL/CIPK信号系统作用机制
•     1.2.1 CBL/CIPK信号系统在不同植物中的研究进展
•     1.2.2 CBL/CIPK信号系统在不同非生物胁迫下的生理功能研究
•     1.2.3 CIPK基因的表达特性研究
•     1.2.4 CBL/CIPK复合体的亚细胞定位
•   1.3 研究目的及意义
•   1.4 技术路线
• 第二章 蒺藜苜蓿CIPK3 基因的筛选、克隆及分析
•   2.1 试验材料
•     2.1.1 植物材料
•     2.1.2 菌株及试剂
•     2.1.3 培养基及相关抗生素的配制
•     2.1.4 植物材料的获取
•   2.2 CIPK基因的筛选
•   2.3 CIPK3 基因片段的克隆
•     2.3.1 蒺藜苜蓿RNA提取
•     2.3.2 cDNA的合成
•     2.3.3 PCR产物的回收
•     2.3.4 CIPK3 基因的生物信息学分析
•   2.4 结果与分析
•     2.4.1 CIPK基因型筛选
•     2.4.2 蒺藜苜蓿RNA提取质量检测
•     2.4.3 蒺藜苜蓿CIPK3 基因cDNA的全长克隆
•     2.4.4 CIPK3基因的结构及功能预测
•   2.5 讨论
•   2.6 小结
• 第三章 蒺藜苜蓿CIPK3 表达水平探究
•   3.1 试验材料
•     3.1.1 植物材料
•     3.1.2 试剂及仪器
•   3.2 试验方法
•     3.2.1 胁迫处理及采样
•     3.2.2 qRT-PCR引物设计
•   3.3 结果与分析
•     3.3.1 CIPK3 基因的组织特异性表达
•     3.3.2 Na Cl处理下CIPK3 的表达分析
•     3.3.3 ABA处理下CIPK3 的表达分析
•     3.3.4 干旱处理下CIPK3 的表达分析
•   3.4 讨论
•   3.5 小结
• 第四章 蒺藜苜蓿CIPK3 基因过表达载体的构建
•   4.1 试验材料
•     4.1.1 菌株
•     4.1.2 载体、酶及试剂盒
•     4.1.3 培养基及抗生素的配制
•   4.2 试验方法
•   4.3 结果与分析
•   4.4 讨论
•   4.5 小结
• 第五章 筛选拟南芥MtCIPK3 基因过表达植株及其功能验证
•   5.1 试验材料
•     5.1.1 植物材料和菌株
•     5.1.2 培养基及抗生素的配制
•   5.2 试验方法
•     5.2.1 农杆菌感受态的制备
•     5.2.2 农杆菌的电转化
•     5.2.3 农杆菌蘸花转染拟南芥
•     5.2.4 CIPK3转基因拟南芥的逐代筛选
•   5.3 结果与分析
•     5.3.1 转基因拟南芥的草铵膦筛选及PCR鉴定结果
•     5.3.2 转基因拟南芥的平板胁迫试验
•   5.4 讨论
•   5.5 小结
• 第六章 讨论及结论
•   6.1 讨论
•   6.2 结论
•   6.3 本研究创新点
•   6.4 展望
• 参考文献
• 附录
• 致谢
• 作者简历

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 赵一鑫

导师: 呼天明

关键词: 蒺藜苜蓿,信号网络,基因克隆,拟南芥转化

来源: 西北农林科技大学

年度: 2019

分类: 基础科学,农业科技

专业: 生物学,生物学,农作物

单位: 西北农林科技大学

基金: 国家自然基金项目“细胞水平多组学解析根瘤调节苜蓿抗旱性的分子机制”(31772660),“根瘤提高苜蓿气孔对ABA敏感性的抗旱分子机制研究”(31572456),农业部现代农业产业技术体系“国家牧草产业技术体系-榆林综合试验站”(CARS-34)

分类号: S541;Q943.2

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