Ⅰ群禽腺病毒的分离鉴定及PCR-HRM分型方法的建立

论文摘要

包涵体肝炎（Inclusion Body Hepatitis,IBH）是由I群禽腺病毒（Fowl adenovirus I,FAV-1）引起的以侵害肝脏为主的家禽传染性疾病。该病的典型症状为心包积水、坏死性肝炎,主要感染36周龄的肉仔鸡,致死率高达80%。该病一旦发生,便可迅速向周围地区蔓延。近年来,在我国多个省市均有该病发生的报道,给我国家禽养殖业造成了巨大的经济损失。因此,加强对该病的研究有助于促进我国家禽养殖业的健康发展。本研究利用PCR方法从山东、江苏、陕西、河北等家禽养殖场送检的疑似“包涵体肝炎”的患禽肝脏组织中检测禽腺病毒,进行病毒分离以及Hexon基因测序,以了解我国部分地区I群禽腺病毒血清型的分布和感染状况。同时利用建立的PCR-HRM方法对分离的腺病毒实现准确、快速的基因分型,该方法可作为开发其他病原体基因分型技术的模型。本研究首先通过SPF鸡胚以及鸡胚肝细胞（CEL）两种分离方式对临床疑似腺病毒感染的肝脏组织进行病毒分离,通过PCR检测、血凝性鉴定、Hexon基因序列测定与分析等试验对病毒分离株进行鉴定。病料组织匀浆上清液接种SPF鸡胚后能导致胚体发育不良,体表潮红、出血,肝脏坏死、肿大,死亡高峰在接种后的67d;病料组织匀浆上清液接种鸡胚肝细胞（CEL）,48h后部分细胞开始变圆、皱缩,72h后70%80%的细胞开始脱落,呈葡萄样聚集,以上结果与报道的I群禽腺病毒的感染特性相符。PCR鉴定结果显示,扩增产物的目的条带与预期大小一致。共分离到15株I群禽腺病毒,分别命名为SD151225、SD150808、SD150930、SD150909、JS151208、SD160309、SD160402、SD160402、SD160318、SD160827、SD160720、SX160723、SD160826、SD160829、SD160930。并测定15株分离毒株的TCID50,分别在10-4.1510-7.5之间。血凝试验结果显示分离毒株均无血凝性。采用PCR方法对15个分离毒株的Hexon基因进行扩增,并与GenBank中发表的I群禽腺病毒各血清型毒株的Hexon基因序列进行比对,结果显示,15个分离株中有10株与血清1型同源性较高,5株与血清4型同源性较高。遗传进化分析结果显示SD160827、SD151225、SD150808、SD150930、SD150909、JS151208、SD160309、SD160402、SD160401和SD160318分离株与血清1型禽腺病毒在同一分支上,其余分离株与血清4型禽腺病毒在同一分支上,说明15株FAV-I分离株可分为2个血清型,其中血清1型10株,血清4型5株。根据GenBank中发表的I群禽腺病毒各血清型毒株的Hexon基因序列,设计一条特异性引物,用于实时荧光定量PCR（Real-time Polymerase Chain Reaction,RT-PCR）和随后的高分辨率熔解（High Resolution Melting,HRM）曲线分析,并确立了它在区分12种FAdV参考血清型方面的能力。将结果与之前的Hexon基因PCR结果进行比较,结果表明,PCR-HRM是区分I群禽腺病毒12种血清型的一种灵敏而特异的方法。所有的熔解曲线都具有高度的可重复性,使用归一化HRM曲线,每个血清型的复制都得到了正确的基因分型。本研究建立的I群禽腺病毒PCR-HRM检测方法灵敏度高、特异性强、重复性好,可用于FAV-1的快速检测。

论文目录

• 符号说明
• 中文摘要
• Abstract
• 1 前言
•   1.1 禽腺病毒的一般生物学研究
•     1.1.1 禽腺病毒分类
•     1.1.2 禽腺病毒形态结构
•     1.1.3 禽腺病毒理化特性
•     1.1.4 禽腺病毒培养特性
•   1.2 禽腺病毒的分子生物学研究
•     1.2.1 禽腺病毒的基因组结构
•     1.2.2 禽腺病毒结构蛋白
•     1.2.3 禽腺病毒非结构蛋白
•   1.3 禽腺病毒流行病学
•   1.4 禽腺病毒检测方法的研究进展
•     1.4.1 血清学诊断方法
•     1.4.2 分子生物学技术
•   1.5 高分辨率溶解曲线技术简介
•     1.5.1 高分辨率熔解曲线的技术原理
•     1.5.2 高分辨率熔解曲线技术的分析方法
•   1.6 本研究的目的及意义
• 2 材料与方法
•   2.1 材料
•     2.1.1 样品来源、鸡胚及细胞株
•     2.1.2 病毒标准株
•     2.1.3 种毒
•     2.1.4 主要试剂
•     2.1.5 主要仪器
•     2.1.6 试验相关试剂和溶液的配置
•   2.2 方法
•     2.2.1 Ⅰ群禽腺病毒的分离鉴定
•     2.2.2 I群 群禽腺病毒 PCR-HRM分型方法的建立
• 3 结果
•   3.1 Ⅰ群禽腺病毒分离鉴定结果
•     3.1.1 Ⅰ群禽腺病毒分离情况
•     3.1.2 病料中Ⅰ群禽腺病毒的PCR检测结果
•     3.1.3 分离毒株血凝性试验结果
• 50的测定结果'>    3.1.4 分离株TCID₅₀的测定结果
•     3.1.5 Hexon基因的PCR扩增结果
•     3.1.6 Ⅰ群禽腺病毒的鉴定结果
•     3.1.7 分离株Hexon基因遗传进化分析
•     3.1.8 病毒纯净度检测结果
•   3.2 Ⅰ群禽腺病毒PCR-HRM分型方法的建立
•     3.2.1 重组质粒的PCR鉴定
•     3.2.2 PCR-HRM反应条件的优化
•     3.2.3 Ⅰ群禽腺病毒PCR-HRM分析方法的建立
•     3.2.4 特异性试验结果
•     3.2.5 敏感性试验结果
•     3.2.6 重复性试验结果
•     3.2.7 临床样本检测结果
• 4 讨论
•   4.1 Ⅰ群禽腺病毒的分离鉴定
•   4.2 Ⅰ群禽腺病毒PCR-HRM分型方法的建立
• 5 结论
• 参考文献
• 致谢
• 攻读学位期间发表论文情况

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 王冬雪

导师: 唐熠

关键词: 群禽腺病毒,分离与鉴定,高分辨率熔解曲线

来源: 山东农业大学

年度: 2019

分类: 基础科学,农业科技

专业: 生物学,畜牧与动物医学

单位: 山东农业大学

基金: 国家水禽产业技术体系项目(CARS-42-19)

分类号: S852.65

总页数: 62

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