人腺病毒36型诱导3T3-L1前脂肪细胞棕色化的作用研究

论文摘要

目的:初步探讨人腺病毒36型（adenvirus type 36,Ad36）在诱导3T3-L1前脂肪细胞棕色化过程中的作用。方法:（1）对MDI诱导组（对照组）和MDI+Ad36诱导组（实验组）第0、2、4、6、8天细胞进行BODIPY染色,观察细胞成脂情况。（2）分别收取对照组与实验组第0、2、4、6、8天细胞,利用实时荧光定量PCR检测两组棕色脂肪标记基因pgc1α、ucp1、fgf21,线粒体氧化磷酸化相关基因atp5o、cox5b、nd2 mRNA表达水平变化;Western blot检测两组上述基因的蛋白质表达水平变化。（3）使用mTOR的抑制剂雷帕霉素后,BODIPY染色检测细胞成脂情况;实时荧光定量PCR与Western blot检测各组棕色脂肪标记基因pgc1α、ucp1、fgf21,线粒体氧化磷酸化相关基因atp5o、cox5b、nd2 mRNA与蛋白质表达水平变化。结果:（1）在3T3-L1前脂肪细胞分化过程中,MDI诱导组细胞内脂滴逐渐增多并汇集,而MDI+Ad36诱导组细胞内脂滴先增多、汇集,在细胞分化的第4天加入Ad36后,与对照组相比,细胞内脂滴大小逐渐减小。（2）实验组细胞分化至第6、8天时,pgc1α、ucp1、fgf21、atp5o、cox5b、nd2 mRNA与蛋白质表达水平都明显高于对照组,且差异均具有统计学意义（P<0.05）。（3）使用mTOR的抑制剂雷帕霉素后,细胞内大脂滴向小脂滴转化的能力明显减弱;棕色脂肪标记基因pgc1α、ucp1、fgf21,线粒体氧化磷酸化相关基因atp5o、cox5b、nd2 mRNA与蛋白质表达水平都明显降低,且差异均具有统计学意义（P<0.05）。结论:Ad36可能通过mTOR上调pgc1α的表达,并进一步使ucp1、fgf21、atp5o、cox5b、nd2的基因表达水平升高,加快甘油三酯的分解与线粒体氧化磷酸化,最终使3T3-L1前脂肪细胞棕色化。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 前言
• 研究内容与方法
•   1.实验材料
•     1.1 实验对象
•     1.2 主要试剂及配制方法
•     1.3 RNA提取及实时荧光定量PCR所需试剂
•     1.4 Western blot相关耗材与试剂
•     1.5 Western blot主要试剂配制
•     1.6 2.5%牛血清白蛋白封闭液配制
•     1.7 本研究所用的主要仪器
•   2.实验内容与方法
•     2.1 构建MDI法与MDI+Ad36法诱导3T3-L1前脂肪细胞分化模型
•       2.1.1 细胞培养
•       2.1.2 3T3-L1前脂肪细胞定向成脂诱导
•       2.1.3 MDI+Ad36诱导3T3-L1前脂肪细胞分化
•       2.1.4 BODIPY与DAPI染色
•     2.2 检测Ad36标记基因e1a与脂肪细胞分化标志基因pparγ mRNA表达水平变化
•       2.2.1 3T3-L1前脂肪细胞总RNA的提取
•       2.2.2 逆转录
•       2.2.3 实时荧光定量PCR
•     2.3 检测脂肪分化标记基因PPARγ蛋白质表达水平变化
•       2.3.1 3T3-L1前脂肪细胞总蛋白质提取
•       2.3.2 Western blot BCA蛋白质定量
•       2.3.3 蛋白质变性
•       2.3.4 SDS-PAGE电泳
•     2.4 检测棕色脂肪标记基因pgc1α、ucp1、fgf21，线粒体氧化磷酸化相关基因atp5o、cox5b、nd2 mRNA表达水平变化
•       2.4.1 细胞总RNA提取逆转录反应
•       2.4.2 实时荧光定量PCR
•     2.5 检测棕色脂肪标记基因PGC1α、UCP1、FGF21，线粒体氧化磷酸化相关基因ATP5O、COX5B、ND2蛋白表达水平变化
•       2.5.1 细胞总蛋白质提取与Western blot检测
•     2.6 使用mTOR的抑制剂雷帕霉素后，检测细胞成脂情况
•       2.6.1 细胞培养
•       2.6.2 细胞换液
•       2.6.3 MDI法诱导3T3-L1前脂肪细胞分化
•       2.6.4 雷帕霉素干预3T3-L1前脂肪细胞分化
•       2.6.5 BODIPY染色
•     2.7 使用mTOR的抑制剂雷帕霉素后，pgc1α、ucp1、fgf21、atp5o、cox5b、nd2 mRNA表达水平变化
•     2.8 使用mTOR的抑制剂雷帕霉素后，棕色脂肪标记基因PGC1α、UCP1、FGF21，线粒体氧化磷酸化相关基因ATP5O、COX5B、ND2蛋白质表达水平变化
•   3.质量控制
•   4.统计学处理
•   5.技术路线
• 结果
• 讨论
• 小结
• 致谢
• 参考文献
• 综述 Ad36与肥胖的相关性研究
•   参考文献
• 攻读硕士期间发表的学术论文
• 导师评阅表

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 刘杰

导师: 关亚群

关键词: 人腺病毒型,前脂肪细胞,分化,脂滴,雷帕霉素,氧化磷酸化

来源: 新疆医科大学

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学

单位: 新疆医科大学

基金: 国家自然科学基金(81873664)

分类号: Q2-3

总页数: 66

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