神经元分裂诱导剂T3和生长/神经营养因子鸡尾酒对成年大鼠皮层细胞影响的蛋白质组学研究

论文摘要

神经科学领域的传统观点认为,成年哺乳动物的中枢神经系统成熟神经元是处于终末分化的细胞,不再具备分裂增殖的能力。而在一些研究中,有迹象表明中枢神经系统神经元可以分裂,但这些研究都缺少关键证据,成熟神经元能否够重新回到细胞周期而进行有丝分裂的问题,一直受到神经科学领域的重视。我们实验室经过十余年的探索,发现以T3（3,5,3′-三碘甲状腺原氨酸）为主要成分的N4（a modified neurotrophin/growth factor cocktail,专利号ZL200710063180.8）可以诱导原代培养的大鼠皮层神经元进行分裂,并通过大量实验证实了T3可以通过下调Necdin的表达影响E2F1、Rb等细胞因子,进而参与细胞周期调控,最终诱导神经元分裂。之后通过对这种cocktail的不断改进,在动物体内实验中也获得成功,利用微透析和立体定位注射的方式将cocktail注射到大鼠皮层,免疫荧光标记后发现有大量的皮层固有神经元分裂。在前期工作的基础上,本研究使用蛋白质组学技术并通过动物行为学实验继续探讨关于T3为主要成分的cocktail对成年大鼠皮层神经元影响。在第一部分的实验中,本实验选用了旷场实验和穿梭箱实验来评价cocktail干预后动物的行为学变化。在前期免疫荧光标记等实验的基础上,发现在cocktail注射区附近有大量神经元分裂,而这种组织学的变化对动物整体所产生的影响需要行为学实验这种更为直观的指标进行评价,旷场实验和穿梭箱实验被神经科学领域广泛采用,并可以较好的体现cocktail干预的效果。我们选用了20个月龄的老年大鼠进行实验,利用显微立体定位技术将1/5浓度的cocktail注射到老年大鼠皮层M1区左右各4个点中,之后进行连续的行为学观测。在连续观测150天后,得出行为学指标数据,另有在cocktail注射前的行为学指标,和另一生理盐水注射组与之进行对照。选取了旷场实验中的“总移动路程”、“中心区域移动路程”,穿梭箱实验中的“无反应次数”作为评价指标进行展示,并采用平均值±标准差的方式展现,以方差分析等方法对实验各组进行差异性检验。通过方差分析,我们发现实验动物在旷场实验中“总移动距离”在coctail注射后35天开始升高,并且注射后与注射前之间存在显著性差异,注射器后第35天与生理盐水注射后有显著性差异,说明cocktail的干预对实验动物在新异环境下的探索及运动能力有所提升。在cocktail注射后,与注射前和生理盐水对照组相比“中心移动距离”也有所提升,但未能体现在统计学差异上。穿梭箱实验需要在cocktail注射前对动物进行训练,动物在声光刺激后应及时逃离以避免接受小剂量的电刺激,“无反应次数”是在预设的刺激发出后,动物并没有出现逃避反应的的次数,可以一定程度反映动物的学习、记忆能力。对比cocktail注射后与cocktail注射前及生理盐水注射组,cocktail注射后的动物“无反应次数”有所下降,提示干预后的动物在一定程度上学习、记忆能力有所提升。值得指出的是,老年大鼠的个体之间差异性较大,表现在老年动物体重差异较大、有些动物因年老患有疾病等因素上,测得数据的标准差较大,实验应加大样本量从而更准确的描述cocktail干预后的行为学变化。在第二部分的实验中,我们利用了蛋白质组学技术,初步分析了T3及cocktail分别立体定位注射干预对皮层大鼠的影响。实验选用成年S-D大鼠,将生理盐水、T3、cocktail分别通过显微立体定位技术注射到大鼠皮层M1区,其中cocktail注射于皮层M1区左右脑各1个点,T3注射于左脑皮层M1区,生理盐水注射于右脑皮层M1区,注射点坐标左右对称。并于注射后6小时、1天、2天取出注射区周围5mm×5mm×5mm的组织,并可根据注射剂不同、注射位置不同、注射后时间不同将这些组织分为12个组,每组2个样本,以进行蛋白进行蛋白质组学研究,通过sRP技术和高通量质谱分析平台共定量到4702种蛋白质。并采用iBAQ（intensity based absolute quantification）这一基于峰面积的无标定量表征所有蛋白质的表达水平,通过log2的对数转换后进行缺失值的处理及应用Shapiro-Wilk检验对数据的正态性进行检验。在利用Width adjustment法归一化后,进行各组间差异蛋白（Region enriched proteins,REP）的筛选,筛选条件为每个分组与其他11个组之间的数据有统计学差异（p-value<0.05）,且平均表达水平应在5倍以上。其中各时间点T3及cocktail与生理盐水对照之间差异蛋白共505种,其中在T3或cocktail组上调的有288种,下调的有217种。再利用Pearson相关性分析,评价各分组之间的相关性,Pearson相关系数在0.461与0.890之间波动,其中各时间点cocktail处理组左侧和右侧相关性较强,各时间点T3及cocktail处理与生理盐水处理相关性较低,提示本实验cocktail的注射对左右侧而言无明显差异,而两处理组相较生理盐水对照组有较好的差异。而主成分分析及聚类分析的结果也印证了以上结论,同时发现时间的分组因素在整个分析中处于重要地位。E2F转录因子家族与在Rb蛋白鉴定结果中出现,并在两处理组与对照组中的差异蛋白富集分析中显著富集并具有统计学意义,且E2F转录因子家族与Rb蛋白在T3、cocktail处理组中呈现上调。而E2F转录因子家族与Rb蛋白在细胞周期、转录调控、及细胞凋亡中具有重要作用。接下来的GO功能注释结果发现各组的生物学过程也存在差异,根据T3与cocktail生理盐水对照组的差异蛋白共显著富集到GO生物学条目129条,其中上调的有70条,下调的有59条,参与包括细胞增殖与分化、神经系统发育相关、胚胎发育相关、Hippo信号通路、Wnt信号通路等多个重要生物学过程。其中有关胚胎发育、神经系统发育等生物学过程可以给诱导成熟神经元分裂的机制探讨提供思路,而显著富集的Wnt信号通路和Hippo信号通路等都参与在神经系统的发生、发育、损伤后修复等重要过程中。蛋白质组学的初步分析给利用以T3为主要成分的cocktail诱导成熟神经元分裂的机制探讨提供了思路。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 前言
• 第一章 cocktail显微立体定位注射皮层M1 区后动物行为学分析
•   1.1 实验材料和方法
•     1.1.1 实验动物
•     1.1.2 实验主要试剂和仪器
•     1.1.3 主要溶液试剂的配制
•     1.1.4 实验方法
•   1.2 统计分析
•   1.3 实验结果
•     1.3.1 旷场实验
•     1.3.2 穿梭箱实验
•   1.4 结果与讨论
• 第二章 cocktail显微立体定位注射皮层M1 区后动物的蛋白质组学初步分析
•   2.1 实验材料和方法
•     2.1.1 实验动物
•     2.1.2 实验主要试剂和仪器
•     2.1.3 主要试剂和溶液配制
•     2.1.4 实验方法
•   2.2 结果
•     2.2.1 检出蛋白定量及差异分析
•     2.2.2 数据的归一化
•     2.2.3 筛选各分组的差异蛋白
•     2.2.4 各组的差异蛋白的GO分析
•   2.3 结论与讨论
•     2.3.1 E2F转录因子家族与Rb蛋白的检出及差异
•     2.3.2 有关转录的生物学过程
•     2.3.3 有关细胞核、染色质的生物学过程
•     2.3.4 有关胚胎发育的生物学过程
•     2.3.5 有关神经系统发育的生物学过程
•     2.3.6 富集到的信号通路
• 第三章 总结与展望
• 参考文献
• 附录
• 作者在学期间取得的学术成果
• 主要简历
• 致谢

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 闻少楠

导师: 刘少君

关键词: 诱导神经元分裂,行为学,化学蛋白质组技术

来源: 军事科学院

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学

单位: 军事科学院

分类号: Q42

总页数: 91

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